寡核苷酸（Oligonucleotide，Oligo，也称小核酸）药物一般由十几个到几十个核糖核苷酸或脱氧核苷酸单链或双链组成。根据结构及作用方式不同可分为反义核酸(Antisense，ASO)、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、核酸适配体（Aptamer）等，其中ASO和siRNA药物应用最为广泛，作用方式见图1。寡核苷酸药物具有研发周期短、特异性强、高效性和长效性等明显性优势，应用于肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、新陈代谢等多个疾病领域。

图1. 寡核苷酸药物作用方式示意图[1]

为便于寡核苷酸药物分析方法开发和纯化工艺筛选，现将相关应用案例和推荐产品进行梳理。本文内容涵盖寡核苷酸分析与制备案例、产品使用指南，欢迎查阅！

寡核苷酸分析与制备解决方案

为保证寡核苷酸的成药性，在寡核苷酸的稳定性、脱靶率、沉默效果中起到重要作用常用的修饰方法有：磷酸修饰、核糖修饰、碱基修饰、生物偶联等，不同修饰及合成工艺带来的杂质为下游纯化和质量控制提出更高要求。表1介绍寡核苷酸纯化填料产品和分析色谱柱。

表1. 寡核苷酸分析及纯化产品推荐

样品纯化 | 离子交换填料

针对寡核苷酸药物下游纯化特点，赛分科技推荐强阴离子交换填料：高分辨率Proteomix POR15-HQ，广适型Proteomix POR30-HQ和低压型Proteomix POR45-HQ，多种粒径满足不同样品需求，助力于寡核苷酸药物纯化。

表2. Proteomix POR-HQ系列填料技术参数

案例1. 不同品牌离子交换填料纯化siRNA样品对比

层析柱: Proteomix POR15-HQ

             进口品牌A (6.6×100 mm，CV=3.42 mL) 

样品分析色谱柱: GP-C18 (1.8 μm, 120 Å, 2.1×50 mm)

样品类型: 某siRNA样品，分子量8 kD，纯度78.7%

上样载量: 10 mg/mL

图2. 不同品牌离子交换填料纯化siRNA样品对比图

该siRNA样品经纯化后，样品纯度显著提升，测试两款填料的洗脱合样纯度均大于95%，控制单杂含量均小于1%，回收率均高于90%，满足到实际生产需求。Proteomix POR15-HQ与进口品牌A纯化性能相当。另两款粒径规格填料，Proteomix POR30-HQ可满足实际应用中的多种样品需求，具有较好的广适性；对于中低压设备、非防爆车间无法使用有机溶剂等情况，推荐使用Proteomix POR45-HQ。

分子大小变异体分析| 体积排阻色谱

案例2. Zenix SEC色谱柱分析寡核苷酸样品

Column: Zenix SEC-150 (3 µm, 150 Å, 7.8×300 mm)

Zenix SEC-300 (3 µm, 300 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0

Flow rate: 0.5 mL/min   

Column temperature: 25 °C   

Detection: UV 260 nm   

Injection volume: 30 µL    

Sample: 1) dA10; 2) dA15; 3) dA20; 4) 5'-ATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCC-3’,35 nt; 5) dA40;  6) dA50; 7) dA60, 0.1 µM each in water

图3. Zenix-C SEC-150/300分析不同链长核酸样品图谱

参考图3显示色谱分离结果，核苷酸（nucleotide，nt）数量大于40 nt在300 Å孔径色谱柱上的分离度更好；小于等于40 nt且碱基数量相差5 nt时在Zenix SEC-150色谱柱可达到基线分离。

案例3. Zenix-C SEC-100色谱柱分析单双链寡核苷酸

Column: Zenix-C SEC-100 (3 µm, 100 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 50 mM PB+400 mM NaCl, pH 7.0  

Flow rate: 0.5 mL/min 

Column temperature: 25 °C 

Injection volume: 5 µL 

Detector: UV 260 nm 

Sample: 0.5 mg/mL AS(反义链)/ DS(双链)/SS(单链),分子量约为5~9 kDa

图4. Zenix-C SEC-100分析单双链寡核苷酸样品图谱

采用SEC分析不同链寡核苷酸样品，流动相中加入一定比例盐溶液进行方法优化，明显改善拖尾情况，图谱显示三种样品可在Zenix-C SEC-100色谱柱进行良好区分。

N-X杂质 | 离子交换色谱

案例4. Proteomix SAX色谱柱分析寡核苷酸N-X杂质

Column: Proteomix SAX-NP5 (5 µm, 4.6×250 mm)

Mobile phase: A: 20 mM Tris, pH 8.0

B: A+1 M NaCl

Flow rate: 0.8 mL/min  

Column temperature: 25 °C  

Detection: UV 260 nm  

Injection volume: 5 µL   

Sample: Mixture of A40-60, 0.4 µM each in water

图5. Proteomix SAX-NP5分析核酸N-X样品图谱

案例5. Proteomix SAX色谱柱分析寡核苷酸N-X杂质

Column: Proteomix SAX-NP3 (3 μm, 4.6×150 mm)

Mobile phase: A: 80% (v/v%) of 10 mM Tris with pH 8 buffer and 20% (v/v%) ethanol；

                       B: 600 mM NaBr in mobile phase A

Flow rate: 0.5 mL/min  

Column temperature: 60 ℃ 

Injection volume: 15 μL   

Detection: UV 260 nm

Sample: Oligonucleotide (N-X deletion series)

图6. Proteomix SAX-NP3分析寡核苷酸N-X样品图谱[2]

因寡核苷酸合成工艺不可避免产生N-X杂质序列，高分辨率阴离子交换色谱柱有效分析该类杂质。Proteomix SAX有5、3、1.7 μm，三种粒径规格，满足高效分析需求。

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参考来源：

[1] Takakura K, et al. The Clinical Potential of Oligonucleotide Therapeutics against Pancreatic Cancer. Int J Mol Sci. 2019 Jul 6;20(13):3331. doi: 10.3390/ijms20133331.

[2] Mirlinda Biba et al. Factors influencing the separation of oligonucleotides using reversed-phase/ion-exchange mixed-mode high performance liquid chromatography columns[J]. Journal of Chromatography A, 2013. DOI:10.1016/j.chroma.2013.06.050.

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