信使核糖核酸（Messenger Ribonucleic Acid, mRNA）疫苗是通过将效应分子以mRNA的形式通过特定递送系统导入机体细胞内，在细胞内表达目标抗原蛋白，从而激发机体产生特异性免疫反应以获得免疫保护的核酸制剂。mRNA序列高度可变的特点为高通量药物开发以及个性化治疗提供了潜在解决方案。

体外转录（In Vitro Transcription, IVT）生产的mRNA模拟细胞内源性mRNA的结构，由五个部分组成（图1）：5ʹ帽子（Cap）、5ʹ非编码区(UTR)、编码抗原的开放阅读框（ORF）、3'UTR和Poly(A)尾。针对药物的结构特征和生产工艺需对其关键质量进行全面评估。

图1. mRNA结构示意图

本文内容涵盖mRNA分析与纯化案例、产品使用指南、文献分析方法推荐等，欢迎查阅！

mRNA分析与纯化解决方案

结合mRNA的药物特征，美国药典委员会（USP）与业内专家共同起草的mRNA疫苗质量分析方法，现已更新至第三版，文件中部分质控方案采用赛分科技对应色谱柱产品。现将mRNA中需要用到的填料及色谱柱进行梳理（详见表1），便于筛选合适的产品，快速建立纯化和分析方法。

表1. mRNA分析&纯化产品选择指南

mRNA纯化 | 亲和层析

体外转录的mRNA高效纯化方式采用Poly(A)尾的特点，根据A=T碱基配对采用dT亲和填料纯化。赛分科技Protemix POR50-dT20亲和填料具有良好的物理化学稳定性，常规样品载量约1-4 mg/mL，具体产品技术参数见表2。对于部分分子量更大的mRNA样品，还可尝试Proteomix POR45-dT20 L，可进一步提升样品载量。纯化工艺开发过程中可参考表3中方式进行方法优化，可提升样品载量和纯化效率。

表2. mRNA亲和填料技术参数

注:①DBC测试方法：驻留时间2 min，上样液为含0.033 mg/mL Oligo A40的100 mM Tris+500 mM NaCl，pH 7.52；

②化学稳定性测试条件：填料分别在表中常规试剂中40℃浸泡一周后测试，结果：载量是原载量的90%以上。

表3. mRNA纯化方案及优化建议

案例1. Proteomix POR50-dT20纯化mRNA

Column: Proteomix POR50-dT20

Sample: mRNA (4000 nt)

图2. mRNA样品纯化图谱

Proteomix POR50-dT20纯化该mRNA样品，载量为2 mg/mL，回收率85.5%，样品洗脱集中，降低后续操作难度。

mRNA原液 | 应用案例

案例2. SRT SEC色谱柱分析mRNA样品纯度（USP方法）

Column: SRT SEC-1000 (5 µm, 1000 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0

Flow rate: 0.8 mL/min           

Detector：UV 260 nm   

Column temperature: 25 °C     

Injection volume: 10 µL  

Sample: mRNA (single-stranded, ≈1000 nucleotides)

图3. SRT SEC-1000分析mRNA原液样品图谱

mRNA链长为1000 nt（nucleotides），采用1000 Å孔径分析，有效分离聚集体和片段。对于链长>4000 nt样品可选择更大孔径SRT SEC-2000色谱柱。USP采用SRT SEC-1000色谱柱用于1000 nt链长的mRNA样品聚集体分析[1]。

案例3. Proteomix RP色谱柱分析mRNA样品纯度

Column: Proteomix RP-1000 (5 µm, 1000 Å, 2.1×100 mm)

Mobile phase: A: 100 mM TEAA  

                       B: 100 mM TEAA+25% ACN

Flow rate: 0.3 mL/min

Detector: UV 260 nm

Column temperature: 50 °C

Injection volume: 10 µL

Sample: mRNA (≈1000 nt)

图4. Proteomix RP-1000分析mRNA样品图谱

采用Proteomix RP-1000反相色谱柱可将不同片段mRNA进行分离；该方法收录USP草案文件用于mRNA片段百分比检测。

LNP及LNP-mRNA | 应用案例

案例4. Monomix MC10 SEC-3000色谱柱分析LNP尺寸分布

Column: Monomix MC10 SEC-3000 (10 µm, 3000 Å, 7.8×300 mm)

Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0

Flow rate: 0.5 mL/min    

Detector: UV 260 nm, 214 nm and MALS

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 20 µL    

Sample: empty LNP (≈100 nm, 1.48 mg/mL)

图5. Monomix MC10 SEC-3000分析LNP样品图谱

mRNA的递送系统以LNP为主，粒径一般较大，采用大孔径体积排阻色谱柱Monomix MC10 SEC-3000更适配，峰型对称性良好，结合MALS检测器可进一步分析其尺寸及分布等特征。

案例5. Zenix SEC-300色谱柱分析LNP-mRNA样品

Column: Zenix SEC-300 (3 μm, 300 Å, 4.6×150 mm) 

Mobile phase: 100 mM Tris acetate+2.5 mM EDTA, pH 8.0

Flow rate: 0.25 mL/min        

Detector: UV 260 nm       

Column temperature: 25 ℃

Injection volume: 50 µL

Sample: mRNA extracted from formulated mRNA-LNP (~2 μg of each sample)    

图6. IP-RP-HPLC was run 1st then SEC was run 2nd[2]

MP (main peak), LP (Late Peak); LNP extracted mRNA (black) & MP (blue) & LP (red)

采用Zenix SEC-300色谱柱分析LNP-extracted mRNA聚集体方法纳入USP草案，用于制剂LNP-mRNA分析。详细分析方法介绍和数据详情可参考文献内容[2]。

残留NTP | 应用案例

案例6. Proteomix SAX色谱柱分析残留NTP样品含量

Column: Proteomix SAX-NP5 (5 µm, 4.6×250 mm)

Mobile phase: A: 100 mM Tris, pH 8.0

B: 100 mM Tris+1 M NaCl, pH 8.0

Column temperature: 25 °C

Flow rate: 0.5 mL/min

Detctor: UV 260 nm

Injection volume: 2 µL

Sample: UTP/GTP/ATP/GAG/CTP

图7. Proteomix SAX-NP5分析残留NTP样品图谱

mRNA体外转录中残留NTP以及帽子类似物检测可采用强阴离子交换柱（Proteomix SAX），该分析方法可区分不同碱基样品，各组分互不干扰。快速分析可采用更小粒径3 μm，更短色谱柱加快分析速度。

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产品使用指南

该内容介绍mRNA样品涉及的液相色谱柱产品的活化、清洗、流动相配置等，可点击查看详情，信息将持续更新。

mRNA色谱解决方案推荐

该内容收录mRNA样品相关文献分析方法和纯化方案介绍，点击可查看详情，内容也将持续更新，欢迎查看。

参考文献：

[1] Analytical Procedures for Viral Vectored Vaccine Quality (Third Edition).

[2] Packer M, et al.A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems[J]. Nature Communications, 2021, 12.DOI:10.1101/2021.09.21.461221.