引言
Introduction
环状RNA（circRNA）由于其独特的闭环结构、高稳定性和对外切酶的抗性，在科研和临床应用中展现出巨大潜力，成为研究基因表达调控、疾病诊断及新疗法开发的重要工具。近日，中检院在《Chemosensors》上发表的研究Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method，通过SEC-HPLC方法详细探讨了circRNA疫苗的表征及降解模式，为circRNA的进一步应用提供参考依据（*查看底部留言区获取文章链接）。文中参考USP法案推荐的mRNA聚体分析SRT SEC-1000体积排阻色谱柱，有效分离circRNA的聚集体、片段等相关杂质，为circRNA降解研究提供关键信息。
背景介绍
CircRNA由线性mRNA进一步环化或IVT共环化得到，无论是mRNA或者circRNA其均具有较高的分子量，相比于常规抗体、蛋白，在未变性条件下的分析检测，常需采用大孔径的色谱柱产品。而市场上大孔色谱柱相对较少，赛分科技在大孔硅胶的研究上具有丰富的经验，满足大孔分析的同时保证硅胶的机械稳定性，适用于mRNA、DNA、病毒颗粒等大尺寸生物样品的分析与质量控制。
CircRNA反向剪接形成的独特闭环结构虽赋予了其高度的稳定性，但伴随其合成过程产生的聚集体、片段、开环样品，以及储存或运输过程的降解产物需进行质量控制。为了探究circRNA的降解机制和产物，研究人员参考美国药典(USP)Analytical Procedure for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics第二版推荐的线性mRNA检测方法。而近期USP发布的第三版草案中，持续推荐赛分科技SRT SEC-1000用于mRNA聚体分析，研究人员也采用该色谱柱用于circRNA的纯度评估与降解模式分析。
文章概述
对于circRNA产品，其研发工艺中容易被忽略的开环RNA、聚集体以及降解产物等杂质的鉴定和分离一直是一大难题，对产品安全性和稳定性造成影响。文章采用赛分科技SRT SEC-1000色谱柱，实现了circRNA样品中各组分的有效分离，提供了关于circRNA疫苗稳定性、聚集物形成以及降解产物积累的关键信息，为保证疫苗质量和安全性提供支持。
聚集体片段分析
色谱柱：SRT SEC-1000(7.8×300 mm,5 μm,1000 Å)
流动相：无Rnase的磷酸盐缓冲液(225 mM NaH2PO4+225 mM Na2HPO4,pH 7.0)
流速：0.3 mL/min
图1.不同温度下处理的circRNA样品稳定性
图1是利用SRT SEC-1000色谱柱检测circRNA样品在4℃、25℃和37℃下的稳定性结果。结果显示，在4℃和25℃条件下，随着存放时间的增加，circRNA样品和聚集比例均发生下降，而RNA降解片段比例出现增加(9%~80%)。在37℃条件下，随着存储时长的增加，circRNA比例下降，mRNA降解片段比例出现增加，而聚集体比例会先增加后降低。因此可以推断，在不同温度存放过程中，circRNA样品和聚集体的降解伴随着mRNA降解片段的形成。
图2. 在circRNA样品中各组分的分析
图2是对circRNA样品中各组分进行进一步分析的结果。研究人员将SEC-HPLC与RP-HPLC结果相结合，实现了样品中闭环、线性前体、nicked、聚体和降解产物的成功分离，验证了其从完整状态到切口状态再到最终降解产物的降解模式。
实验结论
综上所述，研究人员使用赛分科技SRT SEC-1000体积排阻色谱柱，评估了circRNA样品在不同温度下的稳定性及降解模式，较低温度下circRNA样品和聚集体比例均发生下降，较高温度下在降解过程中出现聚集体比例先增加后降低，最终完全降解为片段的情况。该研究对于circRNA降解模式的研究为疫苗储存、运输的安全性和有效性有重要意义。
制备收集推荐
CircRNA由于其环状结构，在分子量上通常与线性mRNA有所不同。因此在制备过程中，通过优化SEC的分离参数和条件，可以实现对circRNA的高纯度分离，提高circRNA的制备效率。特别是当circRNA与线性mRNA的分子量差异较大时，SEC的分离效果尤为显著。
cricRNA纯化制备
色谱柱：SRT SEC-2000(4.6×300 mm,5 μm,2000 Å)
流动相：无Rnase的TE缓冲液
图3.柱纯化富集环状RNA样品
图4.凝胶电泳分析纯化前后环状RNA样品
图3是北京大学魏文胜课题组的案例（点此链接再次阅读），研究人员采用赛分科技SRT SEC-2000色谱柱，对富含circRNA的馏分进行柱纯化，将纯化前后的样品再次进行凝胶电泳分析（见图4），得到高纯度样品，可用于后续药效实验等操作。
案例分享
赛分科技大孔径色谱柱已广泛应用于mRNA以及circRNA的分析。赛分科技国内外客户均有采用体积排阻色谱柱用于mRNA样品分析及制备，并发表相关研究文献，摘录部分文件可再次浏览。
链接：点击以下文章再次阅读，通过SEC分析、制备mRNA样品：
《文献速递 | 光散射技术对rAAV及mRNA-LNP样品生物物理表征》
《文献速递|高纯度circRNA制备收集助力TCR-T药物研发》
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