重组胶原蛋白是采用基因工程技术在合适的宿主中表达并翻译的蛋白或类似胶原蛋白的多肽，相对于天然提取的胶原蛋白，具有批次间稳定、组分可控、生物安全性高和可编辑修饰等优点，广泛应用于美容护肤，皮肤、眼科修复与骨修复等医学保健领域。据行业研究报告显示，我国重组胶原蛋白市场预计到2027年将达到千亿规模。重组胶原蛋白行业已成为功能性护肤市场、医用敷料市场的黄金赛道。
背景简介
胶原蛋白由脯氨酸、甘氨酸以及羟脯氨酸等构成一级结构，氨基酸通过α螺旋使胶原蛋白二级结构趋于稳定，最后3条α链经过左手螺旋构象形成三螺旋结构的原胶原，如图1展示。根据国家药监局对外发布的《重组胶原蛋白生物材料命名指导原则》，可将重组胶原蛋白分为 3 类：①重组人胶原蛋白；②重组人源化胶原蛋白（医疗器械中最主流的重组胶原蛋白类型）；③重组类胶原蛋白（主要用于化妆品领域）。《重组人源化胶原蛋白》行业标准（YY/T1888-2023）文件对重组人源化胶原蛋白的质量控制给出了明确的指导，对于宿主细胞蛋白质（HCP）残量、细胞内毒素等杂质要求提供了明确的质检标准。
图1. 胶原蛋白结构的形成*
重组胶原蛋白的常见表达体系为大肠杆菌和酵母，大肠杆菌表达体系具有遗传背景清晰、发酵成本低、生产周期短和效率高等优点，酵母表达体系具有安全性高、发酵成本低和产量高等优势。赛分科技根据两种表达体系特点开发了大肠杆菌体系纯化方案和酵母体系纯化方案，助力重组胶原蛋白企业实现高品质、高效率的规模化生产。
大肠杆菌体系纯化方案
大肠杆菌表达体系中的主要杂质是细胞代谢产生的宿主蛋白、宿主核酸以及内毒素等，常用亲和层析、离子交换层析等方法去除。如图2的工艺示意图，对于胞内可溶表达的目标产物，首先将菌体进行破碎、澄清过滤等样品前处理；对于有His标签的表达产物，一般选择Ni亲和层析进行目标产物的捕获，待酶切切除标签后，可采用流穿模式再用Ni亲和层析去除His标签、未酶切的蛋白等；精纯则采用离子交换去除内毒素等杂质，同时进一步提升样品纯度。赛分科技琼脂糖基质的Ni亲和填料Agarosix MC90-NTA Ni具有高载量、高回收率的特点，适用于含His标签的重组蛋白的捕获以及酶切后去除标签，配合阴离子交换填料Monomix Mab60-Q，有效纯化重组人源化胶原蛋白，得到满足质量要求的目标蛋白样品。
图2. 大肠杆菌体系制备重组胶原蛋白工艺示意图
亲和捕获应用案例
某重组人源化胶原蛋白样品，表达体系为大肠杆菌，分子量约为70 KDa。经Agarosix MC90-NTA Ni纯化后，从图3电泳图可知，流穿液、洗杂、再生中的含有极少的目的蛋白，一步回收率在90%以上，洗脱峰（lane 6）实现了目的蛋白的富集，有效去杂蛋白，纯化后样品纯度显著提升。
图3. Agarosix MC90-NTA Ni纯化图谱和电泳图
（1. Marker; 2.原样; 3. FT; 4. Wash1; 5. Wash2; 6. Elution; 7. CIP）
酵母体系纯化方案
毕赤酵母作为一种真核表达系统具有目的蛋白表达量高、纯化方法简单、不受内毒素影响等特点，是胶原蛋白重组表达的优势宿主菌株。下游纯化时可通过离子交换层析捕获结合疏水层析精纯，得到高纯度重组胶原蛋白产物。赛分科技推荐Agarosix MC90-MMC复合阳离子交换填料或Monomix HC60-SP阳离子交换填料捕获，结合Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精纯，两步纯化后目的蛋白SEC纯度在95%以上，满足实际生产需求。
图4. 酵母体系制备重组胶原蛋白工艺示意图
应用案例
对某重组人源化胶原蛋白发酵液进行下游纯化，首先用Agarosix MC90-MMC填料进行阳离子交换层析，捕获目的蛋白，之后用Polar MC30-HIC Phenyl进行疏水层析精纯，两步纯化后SEC纯度达到97%，电泳纯度达到99%。
01 MMC捕获方案
Agarosix MC90-MMC阳离子交换层析捕获目的蛋白，如图5纯化图谱及电泳图，流穿液（lane 3）中基本无目的蛋白，洗杂后大分子杂蛋白被成功去除（lane 4），仅剩余少部分降解片段和小分子杂质（lane 5），洗脱后的目的蛋白纯度明显提升且收率较高。
图5. Agarosix MC90-MMC纯化图谱及电泳分析
（1. Marker; 2.原样; 3. FT; 4. Wash; 5. Elution）
02 疏水层析精纯方案
捕获后的样品用Polar MC30-HIC Phenyl进行疏水层析精纯，小分子杂质与目的蛋白分开完全，洗脱合管（lane 5）的SEC纯度达到97%，电泳纯度达到99%，杂蛋白几乎完全去除。
图6. Polar MC30-HIC Phenyl纯化图谱及电泳分析
（1. Marker; 2.原样; 3. FT；4. Wash; 5. Elution合样）
小结
Agarosix MC90-NTA Ni填料的蛋白载量高，具有良好的化学稳定性，配合Monomix Mab60-Q阴离子交换填料，有效纯化大肠杆菌体系重组人源化胶原蛋白（点击链接阅读，了解更多Agarosix MC90-NTA Ni产品信息）。酵母体系推荐Agarosix MC90-MMC复合阳离子交换填料捕获和Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精纯，两步纯化后目的蛋白SEC纯度在95%以上，满足高纯度、高收率的生产要求。
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*参考文献：
[1] BERISIO R, et al. Crys tal structure of the collagen triple helix model [(Pro-Pro-Gly)10]3 [J]. Protein Science, 2002, 11(2): 262-270.
[2] 潘家豪, 等. 重组胶原蛋白表达体系研究进展[J]. 合成生物学, 2023, 4(04): 808-823.
[3] 徐兰举, 等. 重组人源Ⅲ型胶原蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化工艺[J]. 南开大学学报（自然科学版），2024, 57(03): 40-45.
