寡核苷酸（Oligonucleotides）是短链核苷酸总称，是继小分子类药物和抗体药物后的再一次研发浪潮，也是近几年研究的热点领域。寡核苷酸药物也称小核酸药物，包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、核酸适配体（Aptamer）等。目前，全球已有19款寡核苷酸药物获批上市（3款已退市），在市的共有9款ASO药物、6款siRNA药物和1款核酸适配体。寡核苷酸药物具有研发周期短、特异性强、高效性和长效性等明显性优势，成为近年来全球资本和药企争相布局的新赛道。

表1. 2024年已上市小核酸药物梳理

背景简介

　　寡核苷酸化学合成方面包括核苷酸单体合成、递送系统合成和寡核苷酸偶联物合成等，修饰包括核糖、碱基、骨架和递送系统的修饰。碱基合成一般分4步：脱保护（Deprotection, DET）、缩合连接（Coupling, CPL）、加帽反应（Capping，CAP）和氧化稳定（Oxidation, OXI），寡核苷酸合成一般需重复上述步骤添加核苷酸残基以产生特定序列。合成过程伴随杂质产生，如图1结构，寡聚体缺失核苷（“N-1杂质”）或具有磷酸二酯键而不是所需的硫代磷酸酯键（“P=O 杂质”），在合成期间或之后暴露在氧化条件中将 P=S 键转化为 P=O 键以形成 P=O 杂质。这些杂质的分离和去除对下游工艺开发、填料的选择提出了一定的要求。

图1. 寡核苷酸及其类似物结构示意图

纯化方案

　　根据寡核苷酸药物典型生产工艺（如图2），寡核苷酸下游工艺的常见N-X、N+Y、修饰副产物、脱嘌呤成分等杂质（如表2），常用阴离子层析、反相层析、疏水层析等方法去除。阴离子层析通用性强、成本低且分辨率高，通常为寡核苷酸纯化的第一选择，随核苷酸链长逐渐增加，相关杂质的去除难度越大，在阴离子无法满足需求的情况下，可选择保留端基DMT方式，采用反相模式纯化。赛分科技推荐Proteomix POR15/30-MQ和Bio-C18填料，主要适用于siRNA药物和纯化难度较高的寡核苷酸药物生产纯化，满足高载量、高纯度以及高回收率的需求。

表2. 寡核苷酸制备杂质及层析方法

图2. 寡核苷酸药物制备工艺示意图

　　01阴离子交换层析

　　Proteomix POR MQ填料均为亲水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS/DVB）微球，填料表面经赛分科技特殊亲水涂层处理，具有更好的亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。Proteomix POR MQ填料分为15 μm与30 μm两种粒径，小粒径填料具有更高的分辨率及载量；填料配基为混合模式阴离子交换基团，能够提高对N-1、N-2杂质的分离度，对长链（超过50nt）或疏水性较强（DMT on）的寡聚核苷酸分子的纯化尤其推荐。若MQ结合力过强，且非防爆车间无法使用有机溶剂情况下，推荐选择Proteomix POR15/30-Q，且Proteomix POR15/30-Q可用于柱上脱DMT保护等操作。

表3. 阴离子交换层析填料技术参数

应用案例一

　　Proteomix POR30-MQ纯化某siRNA样品，样品长度: 21 nt，关键去除杂质：N-1、N-2、P=O、脱嘌呤杂质等，上样载量为10 mg/mL，纯化图谱见图3。样品纯度纯化前为81.2%，纯化后为94.96%，回收率74%，竞品填料纯度为95.04%，回收率为43.75%，两款填料纯度保持一致，Proteomix POR30-MQ回收率明显高于竞品填料。

图3. siRNA样品纯化及UPLC分析图谱

应用案例二

　　Proteomix POR30-MQ纯化某ASO样品，关键去除杂质：N-1、N-2、P=O杂质等，上样载量5 mg/mL，纯化图谱见图4。样品纯度纯化前为80.73%，经Proteomix POR30-MQ纯化后为95.00%，竞品填料纯化后纯度为91.92%，Proteomix POR30-MQ纯化性能更佳。

图4. ASO样品纯化及HPLC分析图谱

　　02反相层析

　　完全脱保护 (DMT-off) 的寡核苷酸可以通过阴离子交换层析 (IEX) 进行纯化。部分样品结构性质特殊，下游层析难度大，可保留DMT端基，采用反相纯化后脱保护，再采用阴离子精纯的方法。反相层析具备高分辨率优势，在填料选择上，以高分辨率硅胶反相填料为主，赛分科技推荐C18填料，高载量，高选择性和分离效率，使纯化后的样品纯度及N-X、P=O等关键性指标的控制上满足要求。Bio-C18应用于某寡核苷酸样品纯化，纯化后达到生产标准。BR-C18孔径较小，对于分子量偏小的样品载量更高。表4为C18填料的技术参数，文末可填写问卷信息申请试用。

表4. C18填料的技术参数

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　　*参考文献：Klabenkova K, Fokina A, Stetsenko D. Chemistry of Peptide-Oligonucleotide Conjugates: A Review. Molecules. 2021 Sep 6;26(17):5420. doi: 10.3390/molecules26175420.