引言
结合疫苗，尤其是针对2岁以下儿童的疫苗，通过将多糖与蛋白载体偶联，可以提高免疫原性。然而，实验过程中发现，利用白喉减毒毒素(CRM197蛋白)作为载体蛋白而制成的结合疫苗，会存在游离蛋白，影响药物品质，且通过传统方式难以精确检出，具有较高的安全隐患。
艾美卫信生物药业(浙江)有限公司开发的高效液相色谱(HPLC)测定方法，采用了SRT SEC-300(7.8×300mm)色谱柱，配合特定的色谱条件，实现了对游离CRM197蛋白含量的精确测定。与竞品色谱柱相比，SRT SEC-300色谱柱具有更高的分离度和信噪比，能够更有效地将CRM197蛋白从结合物中分离出来，显著提升了检测的灵敏度和精确度。此外，该方法优化了柱温和pH值，确保了方法的稳定性和重复性(专利号CN110018253A，点击文末阅读原文查询文章)。
背景介绍
多糖疫苗抗原(CPS)属于胸腺非依赖性抗原(TI-Ag)，无法充分激发儿童的免疫系统。通过将多糖与蛋白载体偶联，制成结合疫苗，可以将TI-Ag转变为胸腺依赖性抗原(TD-Ag)，从而增强免疫原性，为儿童提供长期保护。然而，在制备结合疫苗的过程中，游离蛋白可能会影响疫苗的免疫效果，甚至引发不良反应。因此，精确检测其含量变得尤为关键。
目前，检测结合疫苗中游离蛋白含量的方法主要是《中国药典》记载的HPLC法。方法的建立，也受到载体蛋白的性质、检测分析柱的选型等各方面的影响。本专利采用赛分科技SRT SEC-300色谱柱，实现了对结合疫苗中游离CRM197蛋白含量的精确测定，保证了精确度与重复性，降低了检测成本，简化了操作流程，有望成为结合疫苗质量控制中的重要工具，为疫苗的安全性和有效性提供强有力的技术保障。
文章概述
在疫苗研究领域，精准测定游离蛋白含量对于确保疫苗的安全性和有效性至关重要。本专利采用赛分科技SRT SEC-300色谱柱，通过优化条件，能够精确测定出结合疫苗中的游离蛋白含量；同时，实验可以将CRM197蛋白的检测限确定在0.15625μg，定量限约为0.625μg，反映了SRT SEC-300(7.8×300mm)色谱柱在低浓度样品中的高灵敏度和准确性，能够减少待测样品的用量，从而降低游离蛋白的检测成本。该方法在疫苗研发、药物筛选评估等方面具有重大意义。
精确度考察
本专利以脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗、肺炎链球菌多糖结合疫苗作为测定样品，依次命名为结合物a、结合物b、结合物c。将样品用0.2M氯化钠稀释样品至蛋白浓度为200μg/mL，各取1mL，分别加入0wt%、1wt%、3wt%、5wt%的CRM197蛋白。以加样回收率来考察精确度，每个样品检测3次进行重复性判定。
色谱柱：SRT SEC-300(7.8×300mm,5μm,300Å)
流动相：0.2M NaCl(pH7.2±0.02)
柱温：23±1℃
流速：0.5mL/min
紫外检测波长：UV280nm
固定进样体积：100μL
结果如下：
图1.结合物a+CRM197蛋白
图2.结合物b+CRM197蛋白
图3.结合物c+CRM197蛋白
图1-图3是向三种结合物加入不同浓度CRM197蛋白的检测结果。由图可知，在设定的试验参数和条件下，SRT SEC-300色谱柱分离度较好(＞1.70)，可重复性高。且进一步计算发现，回收率皆处于80-120%之间，CV%皆小于5%，满足质量标准要求，表示本检测方法准确可信。
表1.不同浓度CRM197蛋白的信噪比
表1是向三种结合物加入不同浓度CRM197蛋白所测得的信噪比。根据检测结果，可以确定有无CRM197蛋白的检测限约在0.15625μg，再结合行业标准中信噪比＞10.0的规定，可以确定CRM197蛋白含量的定量限在0.625μg左右。
根据定量限的数值，大致可以确定进样样品中总蛋白含量最小应在12.5μg以上为佳。本专利中，进样样品中总蛋白含量在20-50μg，可有效降低样品的使用量，具有检测结果精确、检测成本低的特点。
实验结论
综上所述，SRT SEC-300色谱柱，展现出了快速、高效的分离性能，能够在确保高分离度的同时，维持良好的信噪比，在特定的柱温和pH条件下，能够满足对游离蛋白含量精确测定的高标准要求，这对于保证结合疫苗的安全性和有效性至关重要。
产品介绍
赛分科技SEC系列色谱柱，采用特有的表面修饰技术，分离速度快，分辨率高，通用性好，批次重现性强，适用于质控QC放行，也是分析型SEC值得信赖的产品。
图2.赛分科技SEC固定相表面修饰工艺
“-C”系列产品，采用赛分科技独有的固定相修饰工艺（见图2），硅胶表面键合一层“平躺”的单分子层，最大程度减少非特异性相互作用。“-C”系列产品适用于疏水性较强的样品，可以减少有机相的使用，安全、环保，让您的实验无后顾之忧。
延展阅读
体积排阻色谱法适用于从小规模实验室研究到大规模工业生产的广泛需求。赛分科技SEC系列产品具有柱容量大、操作简单、易于自动化的特点，能够稳定、连续地处理大量样品，满足治疗性蛋白在疫苗研制、临床试验乃至商业化生产中的高通量需求。
链接：点击以下文章再次阅读，了解SEC操作指南，为您的实验保驾护航。
《SEC方法流动相配制指南》
《色谱柱保养小贴士：SEC/IEX色谱柱清洁指南》
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