引言

　　日常的液相实验操作中，流动相配制是实验技术人员需要掌握的基础。流动相的选择和配制不仅影响样品的溶解度和分离效果，还直接关系到色谱柱的寿命和仪器的使用性能。因此，掌握流动相的配制技巧对于获得准确的色谱分析结果至关重要。

　　本期我们以体积排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography，SEC）为例，与大家分享一些流动相配制方面的技巧小贴士，帮助大家获得稳定可靠的分析结果。

　　流动相选择

　　生物大分子的SEC方法，最常用的流动相是磷酸缓冲盐。通常情况下，SEC的分离效果不受流动相的影响。若峰形受到静电吸附作用及疏水作用的影响，造成拖尾或出峰异常等现象，则可以在流动相中加入高盐或有机试剂来进行改善。常用的有机试剂包括：异丙醇、乙腈等。

　　选择要点

　　1.样品在选用的流动相中有较好的溶解性和稳定性；

　　2.流动相需在色谱柱的耐受范围内使用，包括流动相的pH、有机相比例等。通常硅胶基质的SEC色谱柱，耐受流动相的pH范围为2.0~8.0，如需在缓冲盐中加入有机试剂，有机试剂的添加比例需控制在20%以内。

　　配制步骤

　　1.150mM PB缓冲盐：

　　称取Na₂HPO₄·12H₂O 62.01g和NaH₂PO₄·2H₂O 19.795g置于2L烧杯中，加入2000mL超纯水。用磷酸或氢氧化钠溶液微调至pH7.0，抽滤。

　　2.150mM PB缓冲盐+5%异丙醇（体积比）：

　　按上述方法配制150mM PB缓冲盐（pH7.0）950mL，加入50mL异丙醇，超声15min。混合均匀，现配现用。

　　3.20mM PB缓冲盐+250mM NaCl：

　　称取NaH₂PO₄·2H₂O 1.59g和Na₂HPO₄·12H₂O 3.51g以及NaCl 14.61g ，加入1000mL超纯水，微调至pH7.0，抽滤 。

　　4.如需其他pH磷酸盐缓冲液，可以参考以下配比表，根据实际需求进行配制。

表1.不同pH的磷酸盐缓冲液配制表

*A液：0.2M NaH₂PO₄水溶液；B液：0.2M Na₂HPO₄水溶液

　　注意事项

　　1.当系统内原为缓冲盐溶液需替换为高有机相比例（纯）溶剂或系统内原为高有机相比例（纯）溶剂需替换为缓冲盐溶液时，必须先用纯水或低有机相比例溶剂（如小于20%有机相）过渡。过渡时，通常设定流速为实验流速的一半，冲洗2倍柱体积。

　　2.流动相最好现配现用：乙腈挥发快，易导致有机相比例变化；磷酸盐缓冲液易长霉长菌。

　　3.流动相一般贮存在玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能用塑料容器贮存。

　　4 缓冲盐流动相连续使用一般不超过两天。

　　实验要领

　　1.过滤和脱气：

　　将配制好的无机盐缓冲液通过0.45μm或更小孔径水系滤膜进行过滤，以去除其中的不溶性颗粒。同时，使用超声波或真空脱气机对流动相进行脱气，以消除其中的气泡，确保色谱分析的稳定性和准确性。

　　2.调整pH：

　　合适的pH值有助于改善样品的溶解性和分离效果。通常SEC色谱柱流动相需要保持在pH7.0中。

　　3.色谱柱保存：

　　若长期不用时，SEC色谱柱建议保存在含0.02%NaN3的150mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）或20%乙醇中，以防止菌体污染。

产品介绍

　　在建立SEC方法时，需根据样品分子量大小、尺寸大小等信息，选择合适孔径的色谱柱，此外要根据分离目的，选择合适的粒径和填料工艺。赛分科技SEC系列色谱柱，采用特有的表面修饰技术，分离速度快，分辨率高，是分析型SEC值得信赖的产品。

图1.赛分科技SEC固定相表面修饰工艺

　　“-C”系列产品，采用赛分科技独有的固定相修饰工艺，硅胶表面键合一层“平躺”的单分子层，最大程度减少非特异性相互作用。适用于疏水性较强的样品，可以减少有机相的使用，“-C”系列产品安全、环保，让您的实验无后顾之忧。

　　赛分科技SEC系列色谱柱，分离范围广，适用于多种细分领域，下表是部分产品的分离范围。

表2.赛分科技SEC色谱柱分离范围