引言

　　糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白参与较多生物学过程，如膜相关酶活性、细胞信号转导、细胞粘附和抗原呈递等。GPI锚定蛋白生物合成过程的异常通常引发多种疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿、智力障碍和癫痫发作等。

　　2024年1月，中科院分子细胞科学卓越创新中心(上海生化细胞所)与复旦大学生物医学研究院/附属口腔医院屈前辉课题组在《Nature Communications》发表了Molecular basis of the inositol deacylase PGAP1 involved in quality control of GPI-AP biogenesis的研究论文(点击文末阅读原文查询文章)。文中利用高效液相色谱(HPLC)系统结合耐热绿色荧光蛋白(TGP)表达，设计了一种基于荧光检测体积排阻色谱(FSEC)的耦合分析方法。这种方法使用赛分科技产品Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱，实现了脂质重塑酶PGAP1底物(TGP3)和最终产物(TGP0)的分离，具有高灵敏度、可重复性和便利性。

背景介绍

　　在哺乳动物细胞中，糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)在细胞信号转导、细胞黏附、催化等方面发挥重要作用，其合成缺陷导致严重的先天性神经发育紊乱。GPI-APs途径包括合成与重塑两个阶段，涉及20多步膜内催化反应。因此，需要阐明这一重要的翻译后修饰生物发生过程的分子机制，以助力其特异性靶向药物研发。

　　目前，对含有GPI的底物/产物的分析主要依赖于半定量方法，如薄层色谱或SDS-PAGE。但由于GPI-APs脂肪酶成分复杂，该方法有一定局限性。因此研究团队设计了一种基于荧光检测体积排阻色谱(FSEC)的耦合分析方法，可以实现PGAP1底物和最终产物的分离。

文章概述

　　GPI-APs的分泌和质量控制需要由进化上保守的PGAP1启动的附着后重塑。研究团队设计了一种基于荧光的新型、简便、灵敏的生化分析方法，对其酶学性质进行了表征，并采用哺乳细胞与酵母细胞水平的活性体系对其功能进行了鉴定。继而通过细胞工程方法，捕捉PGAP1与GPI锚定蛋白的复合物，并采用冷冻电镜手段，分析了三个PGAP1在脂环境及与产物复合物的高分辨率结构(2.66−2.84Å)，解析了其10-跨膜结构和产物-酶相互作用的机理，揭示了PGAP1介导GPI-AP脂质重塑过程的分子机制，对于进一步深入理解减数分裂重组形成过程有着十分重要的意义。

　　文章选用赛分科技Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱，利用SEC-HPLC系统与TGP荧光相结合的方式，实现了PGAP1底物和最终产物的分离，在GPI研究领域潜力巨大。

产物检测

　　将混合物在4°C下以21,000g离心10分钟，然后采用Zenix-C SEC-300(3μm,300Å)色谱柱进行上样。在482/508nm波长进行荧光检测体积排阻色谱(FSEC)的监测。TGP0(产物)可以通过使用已知量的TGP0获得校准的FSEC峰强度来量化。

图1.不同条件处理TGP的FSEC结果

　　图1显示了cPGAP1、PI-PLC、PI-PLC分别加20、50 ng的cPGAP1以及不加酶处理TGP3的FSEC结果，结果显示，Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱能够从游离TGP中分离出来自偶联反应的产物(TGP0)，该产物以cPGAP1-、PI-PLC-和剂量依赖的方式出现。

图2.是否采用PI-PLC处理各冷冻电镜样品的FSEC曲线对比

　　图2是PI-PLC对不同冷冻电镜样品影响的图谱(单次实验)。FSEC分析显示，样品中有很大一部分TGP3被水解成TGP2，TGP2通过过量的PI-PLC转化为TGP0。TGP2和TGP3(~30kDa)都携带酰基链，因此可以形成detergent mcelles形式(~70kDa)，减少了在Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱中的保留时间，从而实现PGAP1底物(TGP3)和最终产物(TGP0)的分离。

实验结论

　　该研究设计了一种基于荧光检测体积排阻色谱(FSEC)的耦合分析方法，采用Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱实现了PGAP1底物(TGP3)和最终产物(TGP0)的分离，可以满足实验要求，助力GPI相关分子机制的探究。

产品介绍

　　赛分科技SEC系列色谱柱，采用特有的表面修饰技术，分离速度快，分辨率高，通用性好，批次重现性强，适用于质控QC放行，也是分析型SEC值得信赖的产品。

图3.赛分科技SEC固定相表面修饰工艺

　　“-C”系列产品，采用赛分科技独有的固定相修饰工艺，硅胶表面键合一层“平躺”的单分子层，最大程度减少非特异性相互作用。适用于疏水性较强的样品，可以减少有机相的使用，“-C”系列产品安全、环保，让您的实验无后顾之忧。

　　赛分科技SEC系列色谱柱，分离范围广，适用于多种细分领域，下表是部分产品的分离范围。

表1.赛分科技SEC色谱柱分离范围