抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugate，ADC)由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成，兼具传统小分子化药的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性，由抗体(Antibody)、连接子(Linker)、有效载荷(Payload)毒素分子三部分组成。理想的ADC分子应当具有高靶向性，精准结合目标靶点，毒素分子可以从血浆中稳定通过并到达目的地(例如癌细胞)再释放，发挥毒素分子的作用。因而这三个组成部分对药物使用效果都有至关重要的影响：抗体的靶点选择、特异性、亲和力、内化效率，可降解连接子的稳定性、不可降解连接子与小分子毒素复合物对肿瘤细胞的杀伤力、连接子与抗体的偶联方式，以及小分子毒素的选择是ADC药物开发过程中的主要考量点。

 ADC药物结构示意图*

ADC药物的偶联方式

　　随着抗体制备技术和偶联技术的不断进步，现阶段的ADC候选药物已经克服了一系列问题，如药物靶向性不足、药物毒性大、异质性高、连接子不稳定等。此外，药物抗体比(drug-antibody ratio，DAR)大于4的ADC存在耐受性低、体内疗效低以及血浆清除率高的问题，因此优化偶联技术，控制DAR值是目前ADC药物研究的重要方向，而位点特异性偶联(site-specific conjugation)技术是解决ADC药物关键质量属性DAR的关键。经过三代技术的革新，位点特异性偶联技术逐渐成熟，表1中总结常见集中偶联方式及其特点。此外，偶联技术整体决定可能引入的工艺相关杂质，因而偶联技术的选择与下游纯化方案息息相关，根据不同的偶联方式可推测出偶联后将采用的纯化方案(见表1)。

 常见ADC药物偶联方式及其特点*

　　ADC药物由抗体与有效载荷相结合，已上市ADC药物中均以单抗作为ADC靶向偶联抗体，有效载荷主要为细胞毒药物(已上市药物主要有微管抑制剂、DNA损伤剂为主)，具有强细胞毒性，进入体内如果发生脱靶(off-target)对正常细胞有较高损伤，因而需要保证ADC药物中游离细胞毒分子控制在很低水平且保证ADC较小的脱靶情况，尽可能减小药物的毒副作用。下游纯化是保证药物质量的重要方式，对于不同的偶联方式以及产生的对应杂质，需配合合理的纯化工艺以保证终产品的质量。

 偶联反应常见引入杂质及去除方法

ADC药物生产及下游纯化

　　随着ADC药物偶联技术的发展，ADC药物的偶联工艺逐渐从随机偶联演进为现代定点偶联，对应的药物制备工艺分别为化学法偶联制备和酶法偶联制备两大类，化学法偶联主要为随机偶联，以赖氨酸偶联和半胱氨酸偶联为代表，技术相对成熟，工艺开发时间较短，药物制备流程(如下图2)伴随毒素小分子、聚集体等杂质产生，一般采用TFF、阳离子交换层析(CEX)去除，可选疏水层析(HIC)进行DAR值控制，去除异质体;赛分科技推荐阳离子交换填料Agarosix HC75-S和疏水填料Monomix MC30-HIC Butyl，高效纯化获得高纯度样品。

化学法偶联制备ADC药物的生产及纯化流程

　　酶法偶联制备ADC药物，定点偶联可有效解决化学偶联的异质性问题，DAR和位点均一性好，批次间一致性高，具有更好的稳定性。实际生产中可分为一步偶联和两步或多步偶联两种(如下图3)，一步偶联后的ADC粗品常采用亲和层析加阳离子交换层析进行纯化，去除残留的酶、未反应的裸抗等杂质;两步或多步偶联法中先将Linker加到抗体上，形成中间体，中间体的纯化常选用亲和层析加阳离子交换层析的方法，之后再将有效载荷Payload与中间体上的Linker结合，形成ADC粗品，ADC粗品可选择切向流过滤(TFF)或阳离子交换层析，去除未反应的小分子Payload、酶反应中的小分子副产物、盐离子以及进行缓冲液交换，最后得到ADC的终产物。赛分科技推荐亲和填料MabPurix A65 Excel和阳离子交换填料Agarosix HC75-S或Monomix Mab60-SP，具有高载量、高纯度和高回收率的优势，为ADC药物下游纯化工艺优化保驾护航。

　　有效载荷毒素分子的生产过程中的下游纯化通常采用正向相层析或反相层析去除，赛分科技推荐的硅胶基质HP-Silica正相填料、BR-C18(2)反相填料和聚合物PolyRP反相填料。

酶法偶联制备ADC药物的生产及纯化流程

ADC药物纯化推荐填料

　　Monomix MC30-HIC Butyl疏水填料

　　ADC偶联后存在不同DAR值样品具有疏水性差异，理论上可选择疏水层析介质用于纯化不同DAR样品。实际操作中，疏水层析填料需要极高的分辨率(小粒径填料)才能保证分离不同的DAR值的样品。

　　填料特点

　　高机械稳定性，良好的耐压性能

　　适中的疏水性

　　高化学稳定性，可耐受pH 2-13

　　高分辨率、高回收率

　　MabPurix A65 Excel亲和填料

　　裸抗与毒素分子偶联方案中采用酶的情况下，多采用亲和+离子交换的方法纯化ADC药物。MabPurix A65 Excel具有高载量、高回收率，对于单抗、双抗以及ADC样品具有良好的纯化效果。

　　填料特点

　　高载量,其中A65 Excel动态载量高达70 mg hlgG/mL resin

　　低Protein A脱落，高HCP去除效率

　　高交联度，耐压达0.3 MPa

　　有效去除聚集体，降低后续纯化压力

　　填料反压低，易于放大

　　Agarosix HC75-S离子交换填料

　　Agarosix HC75-S为强阳离子交换填料，填料表面的高度亲水性使得样品与固定相间的非特异性吸附降至最低。高交联基球的基架，使Agarosix HC75-S具有良好的压力/流速特性，广泛适合于单抗、双抗及偶联后的ADC药物的下游纯化。

　　填料特点

　　高结合载量和极好的生物相容性

　　高效去除聚集体

　　高分辨率、高柱效和高回收率

　　易于放大

　　Monomix Mab60-SP离子交换填料

　　Monomix Mab60-SP为强阳离子交换填料，具有高分辨率、高载量，对于ADC药物中裸抗以及偶联后药物的纯化均应用广泛。将填料保存于DMSO溶剂中一周后再测试其DBC，结果显示无显著变化(100.2%)，该填料对DMSO表现出有良好的溶剂耐受性。

　　填料特点

　　刚性基质可耐受高压和高流速

　　高结合载量、高分辨率、高柱效和高回收率

　　高度亲水性表面，可忽略的非特异性吸附

　　常规装柱条件下，体积变化小

　　HP-Silica正相填料

　　HP-Silica正相填料采用高纯度的硅胶为基质，具有高选择性、高分辨率和高重现性，采用极性固定相，可与极性化合物发生作用，非常适合于分离各种化学物质，如多肽、蛋白、糖类、核苷酸、维生素、类固醇、极性药物分子和酸、中、碱性有机化合物等。ADC药物常用毒素分子纯化推荐粒径10 μm、孔径120 Å的HP-Silica填料。

　　填料特点

　　采用高纯硅胶作为原料(金属杂质<10 ppm)

　　高的化学稳定性，低固定相流失高的选择性和分离效率

　　高上样量，高机械强度

　　BR-C18(2)硅胶反相填料

　　BR-C18填料以高纯度球形硅胶为基质，具有良好的耐碱性能、耐压性好、反压低及高流速下分辨率良好等特点，ADC药物有效载荷常用毒素分子的纯化推荐粒径8 μm、孔径100 Å的BR-C18(2)填料。

　　填料特点

　　以高纯硅胶为原料

　　高载量、高机械强度

　　高的选择性和分离效率

　　高度批间重现性，易于放大

　　PolyRP聚合物反相填料

　　PolyRP-10-100填料(粒径10 μm、孔径100 Å)采用高交联度的聚苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)作为基质，基质骨架本身就具有的强疏水性能，使其具有粒径分布均一、粒径可控、耐受pH范围宽等优点。

　　填料特点

　　良好的物理及化学稳定性料

　　刚性基质可耐受高压和高流速

　　高分辨率、高柱效和高回收率

　　高度批间重现性，易于放大

　　Sepax

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