mRNA疫苗具有靶点明确、开发迅速、安全性好等优势，在疫苗开发中发展迅速。但mRNA疗法在稳定性、瞬时表达、免疫原性等方面仍存在挑战。相比之下，通过独特的剪切机制形成闭合环状结构的环形RNA（Circular RNA，cir‐cRNA）具有结构稳定、持久的蛋白表达能力和低免疫原性的优势，其研发热度进一步升级。

circRNA生产工艺中产生的前体线性RNA（Precursor）、环化产生的非目标RNA、开环异构体切口RNA（Nicked）等杂质的存在，要得到高纯度的目标样品，需尽量去除其他构型样品。下文整理circRNA样品分析和纯化应用案例，为分析方法和纯化工艺开发提供参考指南，欢迎查阅！

circRNA分析与纯化产品选择

circRNA样品分析

案例1. SRT SEC-1000色谱柱分析circRNA样品纯度

Column: SRT SEC-1000 (5 µm, 1000Å, 7.8×300 mm )

Mobile phase: 150 mM PB, pH 7.0

Flow rate: 0.8 mL/min

Detector: UV 260 nm      

Column temperature: 25 ℃

Sample: circRNA (≈2000 nt)       

Injection volume: 10 µL

图1. SRT SEC-1000分析circRNA样品色谱图

案例2. Bio-C18色谱柱分析circRNA样品不同构型

Column: Bio-C18 (5µm, 300Å, 4.6×250mm)

Mobile phase: A: 100 mM TEAA   

B: 95%乙腈+5% A相

Flow rate: 0.5 mL/min  

Column temperature: 50 °C  

Detection: UV 260 nm  

Injection volume: 2 µL   

Sample: Nicked RNA, 2500 nt; Precursor RNA, 2800 nt; circRNA, 2500 nt

图2. Bio-C18分析circRNA样品不同构型图谱

circRNA样品采用大孔径体积排阻色谱柱可有效分析聚集体和碎片峰，核苷酸数量一般低于4000 nt（nucleotide, nt）建议采用SRT SEC-1000，更大RNA样品可以采用2000 Å孔径使用。该分析方法可有效用于高纯度环形样品制备，流动相简单且无有机相。

当检测不同结构circRNA样品，可采用较大孔径反相Bio-C18色谱柱，具有更高分辨率，将环形、线性和开环结构组分区分。

circRNA样品制备

案例3. SRT SEC-1000制备柱纯化circRNA

Column: SRT SEC-1000 (5 µm, 1000 Å, 30×300 mm)

Mobile phase: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 75 mM PB, pH7.4

Flow rate: 10 mL/min

Column temperature: 25 °C

Detection: UV 260 nm

Injection volume: 2 µL

Sample:  circRNA(digested by RNase R exoribonuclease)

Loading: 4 mg

Fractions were collected and testified with agarose gel electrophoresis.

图3. SRT SEC-1000制备柱纯化circRNA及检测图谱[1]

案例4. SRT SEC-2000色谱柱制备circRNA

Column: SRT SEC-2000 (5µm, 2000Å, 4.6×300mm)

Mobile phase: RNase-free TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 6)

Flow rate: 0.3 mL/min 

Column temperature: 50°C 

Detection: UV 260 nm

Injection volume: 2 µL

Sample: 剪切反应后的RNA混合溶液

图4. circRNA体积排阻方法制备及检测图谱[2]

circRNA纯化方法中通过引入外切酶RNase R，有效降解线性样品而不影响环形结构，再结合SEC方法纯化，可快速有效制备高纯度circRNA，参考案例3和案例4应用数据。

还可通过反相的方式进行纯化，选择粒径较小、孔径较大反相填料，如Bio-C18，也可用于circRNA纯化。但纯化方案中需引入有机相，放大生产需考虑配套设备。

此外，也有研究人员尝试将Poly(A)尾引入环形RNA结构，结合亲和层析的方式进行纯化，提高样品回收率。但操作过程较为复杂，详情可查看对应文献[3]。

circRNA由于其独特的闭环结构、高稳定性和对外切酶的抗性，在科研和临床应用中展现出巨大潜力，成为研究基因表达调控、疾病诊断及新疗法开发的重要工具。赛分科技科提供分析及制备方案，用于circRNA的质量分析及快速制备，协助药企推进该类样品的研发进程。

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产品使用指南

该内容介绍circRNA样品涉及的液相色谱柱产品的活化、清洗、流动相配置等，可点击查看详情，信息将持续更新。

circRNA文献分析方法推荐

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参考文献：

[1] Huanhuan Wei, et al. A flexible, efficient, and scalable platform to produce circular RNAs as new therapeutics[J]. bioRxiv; doi: https://doi.org/10.1101/2022.05.31.494115.

[2] Wesselhoeft R A, et al. RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo[J]. Molecular Cell, 2019.DOI:10.1016/j.molcel.2019.02.015.

[3] Lulu Wei, et al. A poly(A) polymerase and oligo(dT)-dependent method for the purification of engineering circular RNAs that enhances protein expression in eukaryotic cells[J]. bioRxiv 2024.12.27.630476; doi: https://doi.org/10.1101/2024.12.27.630476.

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