引言
Introduction
单克隆抗体（mAb）的互补决定区（Complementarity-Determining Region，CDR）中氨基酸的氧化修饰会显著影响抗体与抗原结合的能力以及生物学活性。在2020版中国药典中，对mAb供试品氧化产物等杂质进行定量分析，是单抗制品检定的重要指标之一。近期，赛分科技客户复宏汉霖于ACS Pharmacol.Transl.Sci.上发表相关文章（*点击底部左下角“阅读原文”获取文章链接）。文中介绍了一种基于疏水相互作用色谱（HIC）的方法，用于量化和表征CDR区域中的甲硫氨酸氧化变体（Met-Ox）。研究人员利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水分析柱及半制备柱，成功分离和富集目标单抗的氧化变体。赛分科技HIC色谱柱在异质体分离方面效果显著，不仅适用于抗体的分析和稳定性评估，而且对样品制备和生物学功能研究提供重要支持。
背景介绍
IgG类抗体是目前临床治疗中最常用的抗体类型之一。对于IgG而言，氧化修饰作为质量检验的一个重要指标，在评价抗体的稳定性和功能性方面至关重要，特别是Met-Ox对抗体与抗原之间的亲和力有着直接影响。在实际研发生产中，可采用半制备的方式来分离这些氧化变体，从而进行进一步的体外和体内特性研究，以评估抗体性能。
当前，测定Met-Ox通常采用C18或PS-DVB基质的反相色谱柱进行方法开发，但这种方法往往会导致抗体生物活性受损，不利于后续实验。为了解决这个问题，研究人员选择了赛分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱，可以有效分离目标氧化变体，同时保证产品质量和一致性。
文章概述
本研究通过对特定条件下不同时间点（从0.5 h至24 h）处理的目标抗体mAb-A进行了系统的研究，考察了氧化处理后其分子量、亚单位构象及生物活性的变化。研究发现，随着氧化时间的增长，mAb-A的分子量逐渐增加，这主要是由于重链（HC）上的Met105位点发生了二硫键断裂导致的氧化反应。此外，F(ab')2片段内也发现了两个对称位置的氧化敏感位点，这些位点的氧化使得HIC图谱出现了多个不同的峰组（PG），证实了Met105为主要的氧化位点。进一步研究表明，虽然Met105位点的氧化并不影响抗原结合能力，但它明显降低了mAb-A对PD-1/PD-L1通路的阻断活性。
氧化变体分析
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 0.5 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 30 μg
图1. mAb-A样品分析色谱图
作为mAb-A的参考药物（RMP），Keytruda在CDR区域含有氧化变异体。为了确保mAb-A的质量和与RMP相似性，研究人员建立HIC方法对样品进行了分析，结果如图1所示。图1中，主峰组（MPG）在大约22 - 27 min，峰前组1（PG1）在大约20 - 22 min洗脱。与MPG相比，PG1的洗脱时间更早。
图2. mAb-A及其氧化变体分析色谱图（0.25%的tBHP在0，0.5，4和24h）
为了确认氧化变异体的存在，研究人员在氧化条件下对mAb-A进行了强制降解，随后使用HIC方法进行了分析，结果如图2所示。与对照样品相比，随着氧化程度的增加，MPG逐渐转化为PG1，进而转化为PG2。图中所示，在氧化0.5 h后，样品的MPG百分比降低，PG1升高，并观察到一个新的峰组PG2。在氧化4 h的样品中，MPG的下降和PG1和PG2的增加更为明显。在氧化24 h后，MPG和PG1的峰几乎消失不见，而PG2的峰面积占比达到94%。
表1. LC-MS/MS Trypsin PTM与HIC色谱法结果百分比对比
表1列举了LC-MS/MS Trypsin PTM结果和从分析HIC色谱法计算出的百分比。两种方法得出的结果非常接近，表明HIC色谱分析法可以作为一种快速筛查的有效替代方法。
制备收集
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 10 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 2 mg.
图3.mAb-A氧化变体HIC分析色谱图（0.25%的tBHP氧化4 h）
图3-a.mAb-A氧化变体分级收集
图3-b.mAb-A氧化变体纯度检测
图3是对氧化4 h的mAb-A进行分级收集及纯度检测的结果。其中图3-a是HIC组分收集示意图。图3-b表示将富集的样品超滤三次，然后进行HIC分析来确定各组分的纯度。各组分的分析图谱与制备图谱对比，可以看出半制备规格Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱保持高分辨率，制备的样品保持高纯度。
实验结论
综上所述，研究人员使用赛分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5分析与制备柱，成功地对目标抗体mAb-A的氧化变体进行了分离和富集，制备后的样品可保持生物学活性，可用于后续研究。此方法不仅适用于监测mAb的氧化稳定性，而且在其他mAb的探索性研究和开发过程中也具有广泛的应用前景。
订购信息
