GLP-1药物以其出色的降糖、减重效果，登顶《科学》2023年度突破，被誉为人类对抗肥胖症及其相关并发症的长期斗争中的重要里程碑。在看到司美格鲁肽带来的巨大收益以及市场预期，国内预计已有上百家药企入局GLP-1。在此背景下，工艺开发时间和生产成本效益成为该赛道取得成功的关键。赛分科技对该类药物的生产工艺进行探索，开发出纯化效率高、通用性强的GLP-1多肽药物纯化工艺。对于发酵类GLP-1多肽样品仅使用两款填料（Generik MC60-HIC Butyl+Bio-C8(2)）即可完成粗品到成品的纯化。
GLP-1纯化方案精华一览
Generik MC60-HIC Butyl+Bio-C8(2)
a.高载量、高纯度、高回收率
典型案例：
终产品纯度达99.63%，已知单杂0.11%，未知单杂均小于0.1%
单步回收率90%左右，总收率约77.6%
反相纯化载量15 mg/mL（2.5%）
b.物料成本低
Generik MC60-HIC Butyl纯水洗脱，成分单一，洗脱体积小，适合放大
纯水洗脱，节省酶切前和中纯后两次换盐或稀释步骤
填料寿命长，降低单次填料使用成本，降低质量风险
c.时间成本低
工艺开发周期短，单针生产周期短
无需频繁重装柱子（无色素吸附等问题）
d.工艺稳健，开发难度小
工艺开发简单（0.5 M盐上样，纯水洗脱）
工艺通用性强（目前已有10余个项目复制成功，成功率100%）
工艺稳健性好，且容易放大
背景介绍
胰岛血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，属于肠促胰岛素家族，分泌受进食活动调节，具有血糖浓度依赖性降糖效应，是极有潜力的降糖药物。为了优化药物作用效果，研究者采用改变氨基酸序列、嵌入非天然氨基酸、增加脂肪侧链、偶联蛋白或者PEG修饰，改变剂型等一系列措施，有效延长了GLP-1药物的半衰期，提高患者使用便捷性，现已有多个GLP-1药物在国内上市（表1）。已上市药物中长效的GLP-1药物更受青睐，其中以司美格鲁肽（索马鲁肽，Semaglutide）表现最为突出。与此同时，多靶点药物逐渐成为未来研发趋势，礼来双靶点GLP-1药物替尔泊肽（Tirzepatide，商品名为Zepbound）国外上市后取得亮眼的成绩。
表1. 国内上市GLP-1药物
*此外已上市GLP-1多肽类药物还有：阿必鲁肽（GSK），替尔泊肽（Lily），未在国内上市
GLP-1药物蓬勃发展，国内、外掀起多肽药物开发热潮，无论是原料供应商还是医药公司都纷纷布局，也加大了多肽药物的竞争。在此环境下，高效稳定的药物生产方案可以缩短开发时长、实现降本增效，有利于提高药物竞争优势。赛分科技推出从捕获-中纯-精制完整解决方案，已应用于多个项目，助力生物医药公司GLP-1项目从临床到商品化进程。
GLP-1高效纯化方案介绍
GLP-1药物主要分为两种生产方式，分别为生物发酵（代表药物司美格鲁肽、利拉鲁肽）以及化学合成（代表药物替尔泊肽、艾本那肽），一般而言发酵生产成本相对较低，发酵GLP-1多肽应用更广。赛分科技基于GLP-1多肽药物生产特点，开发一套适用于GLP-1药物纯化工艺，见图1。对于发酵生产GLP-1药物整体纯化推荐两款填料，分别为Generik MC-HIC Butyl加Bio-C8(2)。化学合成多肽则直接采用高效反相纯化方案，满足高载量、高纯度以及高回收率的需求。
图1. 脂肪链修饰GLP-1药物纯化工艺示意图
下文以发酵生产司美格鲁肽样品为例，介绍赛分科技推荐GLP-1高效、经济、高纯度的纯化工艺。GLP-1捕获及酶切步骤推荐使用Generik MC-HIC Butyl疏水层析填料。该填料具有较强的疏水性能，适用于样品捕获及酶切后纯化，表2为该填料技术参数信息。
表2. Generik MC-HIC Butyl技术参数
大肠杆菌破菌上清液捕获
采用Generik MC60-HIC Butyl疏水层析捕获大肠杆菌破菌上清液，纯化图谱见图2，采用Tris体系0.5 M NaCl作上样缓冲液，无洗杂步骤，直接采用纯水洗脱，减少试剂使用，杂质直接在CIP后续步骤去除，工艺简单可重现。
图2. GLP-1大肠杆菌上清液捕获及电泳检测图谱
采用Generik MC60-HIC Butyl捕获破菌上清液，洗脱体积仅有1.8CV，样品洗脱集中。上样载量35 mg/mL。纯化后凝胶图谱显示样品纯度显著提升，收率>90%。
酶切后样品纯化
酶切后样品采用与捕获同一款填料Generik MC60-HIC Butyl，纯化图谱如图3。纯化步骤仅增加低盐洗杂操作，同时载量保持在20 mg/mL，优于一般反相填料载量。
图3. 酶切后多肽样品纯化及HPLC分析图谱
酶切后采用与捕获同一款填料Generik MC60-HIC Butyl进行纯化，载量为20 mg/mL。原样及纯化后样品采用HPLC分析，样品纯度由52.14%提升至94.33%，收率>98%。纯化工艺相对简单，对比捕获步骤仅增加洗杂工艺，且该纯化方案稳定，用于多个样品纯化，成功复刻。
修饰后纯化
司美格鲁肽采用脂肪酸侧链修饰以延长药物半衰期。经过脂肪酸侧链修饰后样品疏水性显著提高，且为保证药物纯度要求，脂肪酸修饰后GLP-1药物多采用反相色谱纯化，一般采用C8或者C18填料。文中实验采用Bio-C8(2)纯化司美格鲁肽（纯化及数据分析见图4），流动相经多次验证以醋酸+乙腈体系纯化效果良好，且成功应用于多个项目。反相纯化载量可达15 mg/mL（2.5%），满足高效纯化需求。
图4. 司美格鲁肽样品反相纯化图谱及纯化效果分析
纯化后根据不同质量要求分别收集不同时间段样品（合样1与合样2）进行分析检测，具体样品纯化前后检测结果见图4。检测方法采用HPLC结合高分辨反相色谱柱对纯化前、后样品进行分析，样品纯度从82.46%提升至99.63%，已知单杂0.11%，未知单杂均小于0.1%，同时回收率在88%以上。对于口服制剂质量相对放宽，可增加收样范围，纯度可达98.47%，回收率显著提高至99.4%。
结语
赛分科技推荐发酵生产GLP-1药物采用纯化方案为Generik MC60-HIC Butyl加Bio-C8(2)，合成多肽药物直接采用反相纯化。两款填料解决整体纯化工艺，保证样品高载量、高回收率、高纯度，且工艺稳健性好，适宜放大生产，同时降低整体纯化流程的物料成本及时间成本，提高GLP-1药物开发竞争优势。
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