在11月8日，赛分科技联合生物制品圈开展“ADC药物的分析方法开发”线上直播交流活动，本次直播对ADC药物关键质量属性（CQA），ADC药物的不同检测方式（包含体积排阻色谱检测ADC及抗体片段、聚体，疏水作用色谱对ADC药物DAR值检测，离子交换对电荷异质性的分析，反相色谱对ADC药物纯度的检测等），及其分析方法优化的途径进行了介绍。直播间各位观众积极提问，主讲人结合自己丰富的实战经验及技术积累，做了解答。在此，我们摘录部分提问，与各位分享。 

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精选问答

　　1.  SEC色谱柱使用有机试剂作为流动相，是否会导致SEC色谱柱寿命缩短？

　　答：硅胶基质的色谱柱可以耐受70%的有机相，如果色谱柱使用有机相体系，那么减少切换盐相的更换频率对延长色谱柱的寿命是有利的；另一方面，在使用色谱柱时注意它的一个保存和维护，硅胶基质的SEC色谱柱在日常维护可以采用6 M盐酸胍，单针进样清洗，另外长期保存的条件建议是50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0 ，含0.02%叠氮化钠或者50 mM 磷酸盐缓冲液pH 7.0，含 20%乙腈。合理的维护和保存可以延长色谱柱的使用寿命。

　　2.  在检测ADC样品中游离药物时，应当如何进行样品前处理？

　　答：在做ADC药物的游离小分子检测时，可以通过乙腈蛋白沉淀，复溶之后再检测；另外也可以不做变性处理采用SEC色谱柱进行直接检测，80Å孔径的Zenix-C SEC-80，可以排阻大分子样品，成功与游离小分子分离，实现快速分析。

　　3.  针对高DAR值的ADC样品进行SEC检测时，发现主峰前延的情况，可以通过什么方法改善分离效果？

　　答：首先考察色谱柱性能是否正常，采用标准蛋白或者验证过的样品去测试，确认色谱柱拖尾因子是否在正常范围内；如果色谱柱性能正常，那么出现主峰前延的情况下，应该是样品和色谱柱有一定的非特异性吸附，考虑在流动相和稀释液中加入一定比例的盐或者有机相去改善次级相互作用。在优化的时候，加入有机相的同时，注意盐不要析出，另外关注仪器压力，加入一定有机相的时候需要相对的降低流速，在升高流速的时候更小梯度的逐步升高。

　　4.  在做抗体连接荧光小分子（蛋白），采用HIC方法分离，连接后发现ADC样品峰响应值低，无法分离出，该怎么进行优化？

　　答：关注该方法采用的检测器，对于含荧光分子的检测，优先考虑采用荧光检测器（FLD）。再通过对比连接色谱柱和不接色谱柱的信号差异，如果发现前后差异很大，可能色谱柱存在吸附问题；对于色谱柱吸附，可以在流动相中加入一定比例的有机溶剂，降低次级相互作用。如果通过加入有机溶剂的方式收效甚微，那考虑是否由于疏水作用色谱较强导致，可能需要更换疏水性相对较弱的色谱柱再进行尝试。

　　5.  离子交换色谱多孔和无孔的差异体现在哪些方面？

　　答：色谱填料是否有孔的差异主要体现在比表面积的差异，有孔的填料相对而言具有更大的比表面积，相对而言它的载量会更高。此外，填料孔径的大小和样品分子大小的相对关系，对分离也有影响。无孔填料是在其微球表面键合基团，可以通过延长间隔臂，减小空间位阻，增加填料所能结合的官能团，从而提高载量。但对于分析色谱柱而言，载量不是色谱填料考虑的优先因素，所以对于分析柱而言载量小不会对分析有什么影响。

　　6.  对于离子交换分离，请问pH洗脱和盐梯度洗脱的各自优缺点有哪些？

　　答：对于离子交换的两种洗脱模式，其主要区别在于：pH洗脱优势在于快速，对分析方法优化比较快，尝试几个梯度就可以得到比较好的结果，而它的缺点在于选择性相对较少，商用的pH试剂较少，可优化的范围也相对较窄；盐梯度洗脱的优势在于可以多角度、多方向进行优化，可以调整盐的种类、盐浓度，并且对不同样品的选择性可以有一些明显的改善效果，盐梯度分析优化的不足在于其分析方法优化更为复杂，对于实验操作而言需要配制不同盐以及不同浓度的盐，相对繁琐。

　　7.  对于ADC药物DAR值分析的时候，对于峰归属问题怎么解决？

　　答：根据ADC药物结构可得，抗体可通过连接子接入不同个数（0~8个）的细胞毒分子，需要对不同的色谱峰进行归属确认，最后可以得到该ADC样品的平均DAR值。如果分析的时候采用HIC模式进行分析的，那么该方法通常采用较高的盐浓度作为流动相，不利于直接连接质谱检测，可以考虑将不同的色谱峰收集，在进行LCMS的检测，更有利于确定不同的色谱峰。另外也可尝试采用RP的分离方式去进行峰分离和检测，有利于MS兼容。

ADC药物结构示意图

　　8.  请问为什么pl>7的抗体ADC更多选择阳离子交换？强阳和弱阳离子交换应该怎么选择？

　　答：一般对于样品pI（等电点）大于7，优先选择阳离子色谱柱分离；强阳和弱阳离子的交换官能团是不同的，弱阳通常是羧酸基团，强阳是磺酸基团，对应不同的pKa值，因而对于不同样品的选择性也不同。对于弱阳交换的离子色谱，在流动相pH与固定相pKa相差2个单位的时候它的选择性相对更好。离子交换色谱的选择是两方面考虑的，即流动相pH和样品pI，流动相的pH值比样品pI小的时候，采用阳离子交换；流动相的pH值比样品pI大的时候，采用阴离子交换。实际分析时还需要注意ADC样品在不同pH值的稳定性，注意避免引起Linker的断裂。

　　9.  ADC药物进行疏水色谱分析时，样品需要使用流动相A（高盐流动相）稀释吗？

　　答：在进样前，需要确认溶剂对样品疏水性的影响，一般会用高盐（流动相A）溶解或者稀释样品，以增加进样前样品的疏水性，避免样品直接流穿；另外需注意样品在高盐时可能会产生沉淀，可以通过预实验（进样前将样品用流动相A稀释一下，看是否产生沉淀）进行验证，如果产生沉淀，建议将流动相A的浓度降低些。

　　10.  请问在选择SEC柱子系列的时候，要考虑抗体或者ADC的哪些特性？才能避免盲目选择？

　　答：对于SEC的选择主要有三个点，其一，就是填料孔径的选择，主要与ADC分子量或者分子尺寸直接相关，明确它的排阻限；其二，考虑填料的粒径和色谱柱的尺寸规格，同等孔径规格下，更小粒径色谱柱可以带来更高的分辨率；第三个方面，考察色谱柱与样品的一个非特异性吸附问题，赛分科技可以提供超低非特异性吸附的色谱柱，可以选择SRT-C/Zenix-C/Unix-C系列的色谱柱产品用于ADC类疏水性较高的药物进行分析。

　　11.  ADC测DAR值HIC法系统适用性如何设定？

　　答：ADC样品DAR值分析系统适用性的确定主要关注ADC样品的DAR值及RSD的测试情况，显示不同DAR值的峰需要在系统适用性样品中体现，此外根据RSD确定该色谱峰的重现性。对于色谱峰分离度及柱效需要结合具体的样品考察，前期研究的时候可以重在积累数据，之后再确定一个合适的分离度和柱效的标准。

本次直播感谢各位观众的热情参与，

我们也收获了宝贵的意见，

之后赛分科技会持续推出关于工业纯化和分析色谱的直播内容，

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