基因治疗作为全新的治疗方式，近年来发展迅速，从最初的罕见病常用药物的开发逐步扩展到肿瘤、神经系统、血液疾病等多个治疗领域，其中以腺相关病毒（Adreno-Associated Virus, AAV）作为载体的基因导入系统应用最为广泛。随着基因药物研发的深入，对产品质量控制日趋成熟，国内外法规、指南相继出台，推动基因治疗行业的发展。赛分科技积极开发AAV质量控制解决方案，在此，介绍用以分析不同血清型AAV样品的空壳率及聚体、游离DNA等杂质分析方法，以供参考。

背景介绍

　　除了目的样品正确组装的实心衣壳（full capsids）, AAV样品在制备过程中存在多种杂质（图1），其中包含空壳（empty）样品、部分组装（partially-filled）、AAV衣壳聚体，游离DNA等，此类物质不仅会增加免疫毒性风险还会降低转染效率，影响药物疗效，因而对该类物质应采取相应措施进行控制。美国药典委员会（USP）提出病毒载体疫苗质量控制草案中提出推荐分析方法，其中目前对于样品空壳率的检测，主要有三种检测方式，分别为分析型超速离心（AUC），电镜检测（TEM），以及离子交换（AEX-HPLC）分析，其中AEX-HPLC分析有利于快速定量分析，方法简便适应性强，并且可以将此方法扩大到样品纯化中，有利于纯化方法的开发。

图1 AAV样品相关杂质示意图

　　去年，赛分科技客户美国加州拜玛琳制药（BioMarin）在自然杂志子刊《Scientific Reports》上发表文章，介绍了体积排阻色谱柱分离AAV衣壳单体、二聚体、多聚体的方法，采用双波长（λ=260 nm，λ=280 nm）检测，不仅可以计算杂质峰比例，通过不同波长下峰面积的比值还可鉴定色谱峰类型：单体实心衣壳与二聚体的的A260/A280比率基本一致，约为 1.34；空心衣壳的比值约为 0.6。另外，A260/A280比率为1.8为纯的DNA色谱峰，A260/A280为2.0时为纯RNA色谱峰。使用该方法，在保证AAV样品与聚体、游离DNA杂质分离情况下，可简便快速对实心及空心衣壳、游离DNA及RNA进行鉴别或者定量分析。

　　赛分科技采用Proteomix POR-Q色谱柱分离AAV样品空壳及实心样品，可用于空壳率检测。AAV SEC-5是赛分科技专为AAV样品检测开发设计，用于分析不同血清型AAV样品聚体及游离DNA样品分析，具有超高分辨率，助力AAV样品质量控制。

AAV5空壳-实心样品检测方法

　　Column: Proteomix POR-Q (15 µm, 1000 Å ,4.6×50 mm)

　　Mobile Phase: A: 20 mM BTP, pH9.5; B: A+500 mM TMAC, pH9.5

　　Flow rate: 1.5 mL/min

　　Column Temperature: Ambient

　　Injection volume: 30 µL

　　Detector: UV检测器波长分别为260 nm和280 nm，串联FLD检测器Excitation 280 nm, Emission 330 nm

图2 AAV5 空壳率检测色谱图

　　该分析方法采用赛分科技Proteomix POR-Q（4.6×50 mm）阴离子交换色谱柱对AAV5样品空壳率进行检测，色谱柱具有大孔径（1000 Å），具有高分辨率和高回收率。色谱图（图2）表明空壳样品与实心样品可以完全分开，根据A260/A280峰面积比可以推测先出峰的样品为empty或者partially-filled样品，后出峰样品为实心AAV。根据色谱峰面积计算矫正因子后可以定量测定空壳样品占比。

AAV8聚体、游离DNA分析检测方法

　　Column:AAV SEC-5 (5 µm, 4.6x300 mm)；SRT SEC-500 (5 µm, 4.6x300 mm)；SRT SEC-1000 (5 µm, 4.6x300 mm)对比分析

　　Mobile Phase: A: 1.8X DPBS; C: 10% Ethanol

　　Flow rate: 0.35mL/min

　　Column Temperature: 25℃

　　Injection volume: 20 µL  

　　Detector:UV检测器波长分别为260 nm和280 nm，串联FLD检测器Excitation 280 nm, Emission 330 nm

图3 AAV8实心样品检测色谱图及色谱峰数据

　　对AAV样品主峰前三个小峰进行分析，根据峰面积比，推测前三个小峰分别是游离DNA以及AAV聚体杂质，主峰峰面积比A260/A280为1.28鉴别为实心AAV样品。

图4 AAV8 实心样品检测放大色谱图

图5 AAV8 空心样品检测放大色谱图

　　同样根据色谱峰积分信息，峰面积A260/A280推测杂质峰为RNA样品，主峰为空壳AAV样品。

　　从三款色谱柱AAV实心（图4）及空壳样品（图5）对比分析色谱图表明AAV SEC-5对该AAV8样品相比于SRT SEC-500及SRT SEC-1000孔径分别为500Å和1000Å两款色谱柱，可以将主峰前杂质峰更好的分离，有利于AAV样品质量控制。AAV SEC-5色谱柱为AAV样品检测开发的专用色谱柱，适应AAV样品分子尺寸及样品特点，因而对比常规体积排阻色谱柱在AAV样品分析中具有明显优势。

　　将AAV SEC-5色谱柱采用同样分析方法应用于AAV2样品的分析，同样发现该色谱柱具有较高的分辨率，成功将AAV主峰前样品杂质进行分离（图6）。

图6 AAV2样品分析色谱图

　　*AAV空壳率检测离子交换色谱柱Proteomix POR-Q以及AAV聚体等杂质分离专用色谱柱AAV SEC-5均已上线，欢迎订购

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