内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分—脂多糖（LPS），在细菌死亡或裂解后释放，其具有强生物活性，微量即可引发机体发热、腹泻、休克等病理反应。根据《中国药典》（2020年版），静脉注射用药的内毒素限度一般为5 EU/kg·h（按患者体重和给药时长计算），而鞘内注射药物的标准更为严格（0.2 EU/kg·h）。美国FDA和欧洲EMA也有类似规定，要求制药企业必须证明其生产工艺能稳定地将内毒素水平控制在安全限度以下。因此在抗体药物等生物制品的生产过程中，内毒素控制是确保产品安全性的关键质量指标之一。

　　1 为什么要去除内毒素？

　　内毒素的化学本质为脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），LPS分子由三部分组成：O-特异性多糖链、核心多糖和类脂A（Lipid A）。其中类脂A是LPS的生物活性中心，也是引起宿主免疫反应的主要部分。类脂A可通过靶细胞的受体蛋白分子相互作用，激活复杂的信号通路，导致机体发生一系列病理反应，造成器官受损、休克甚至人体死亡等。

　　在生物制品生产过程中，除大肠杆菌体系（常用于表达重组蛋白）可直接带来内毒素污染源外，设备、系统、原材料或操作过程等环境因素都可能中引入内毒素污染。例如，细胞培养过程中使用的培养基、过滤器及生产环境污染风险等都可能成为内毒素的来源。此外，内毒素还可能通过与目标蛋白结合的方式进入最终产品中，导致产品污染。

　　在上游研发及培养中采取有效预防措施，可以从宿主细胞选择（优选哺乳动物细胞）、培养基与原料控制（尽量使用无动物源成分培养基）、生物反应器操作（封闭式生产系统）以及环境控制等方面减少内毒素引入。

　　2 抗体下游纯化如何去除内毒素？

　　内毒素在常规条件下带负电，在高盐环境下会凝集，形成较大的聚集体。由于其结构复杂，内毒素在生物制品中难以被完全去除，因此需要通过多种纯化手段进行有效控制。抗体下游纯化是一个多步骤的过程，典型流程包括：亲和层析、病毒灭活及过滤、离子交换层析、除病毒过滤和超滤浓缩等。赛分科技结合抗体下游纯化步骤和层析填料，探究不同层析方法对内毒素的去除效果。

亲和层析

　　原理：1. 非特异性共洗脱：内毒素本身不直接结合蛋白A填料，但可通过疏水作用或离子相互作用与抗体或宿主蛋白结合，随目标产物一同洗脱。

　　2. 抗体依赖性：不同抗体类型（IgG1/2/4）与内毒素的结合强度存在显著差异，其中双特异性抗体因结构特殊性更易形成稳定复合物。

　　优化策略：向淋洗液中加入添加剂：

　　1. Triton X-100（1%浓度）：通过竞争性结合内毒素的类脂A结构域，阻断其与抗体的疏水相互作用。

　　2. EDTA（3 mM浓度）：螯合二价阳离子（如Ca²⁺、Mg²⁺），破坏内毒素聚集体的稳定性。

　　3. L-精氨酸（0.5 M浓度）：提供高离子强度环境，削弱静电相互作用，同时改变溶液极性。

纯化案例

　　蛋白A亲和填料—MabPurix A65 Excel （去除率：2.12 log10）

　　样品信息：某单抗发酵液，上样载量50 g/L

离子交换层析

　　原理：内毒素分子的等电点在2左右，内毒素在pH4~8的缓冲体系中带大量负电荷。通常与阴离子交换填料的正电荷配基相结合，并在高浓度盐时将其去除。而在pH4时，内毒素还是带负电荷，与阳离子交换填料不能结合，对于阳离子交换填料，可以采用目标物结合而内毒素流穿的方式，去除内毒素。

　　优化策略：

　　阴离子流穿：提高上样pH，降低载量。

　　阴离子结合：在淋洗步骤中加入TritonX-100、TritonX-114、精氨酸、组氨酸等添加剂。

纯化案例

　　阴离子交换填料—Monomix Mab60-Q（去除率：2.57 log10）

　　样品信息：某单抗 AC Pool，上样载量150 g/L

　　阳离子交换填料—Monomix Mab60-SP（去除率：1.69 log10）

　　某单抗 AC Pool，上样载量50 g/L

疏水层析

　　原理：内毒素的疏水特性，使得在高盐浓度（大于1.5 M 硫酸铵）时容易发生聚集，且聚集体与疏水填料不结合，而部分未聚集的内毒素与填料结合紧密而不易洗脱，所以，上样时聚集部分直接流穿而去除内毒素，而未聚集部分保留较强（小于0.4~0.5 M硫酸铵），可通过盐梯度洗脱去除结合部分的内毒素。

　　优化策略：在上样样品添加1 M精氨酸，降低内毒素与蛋白质的相互作用，达到去除内毒素的目的。

纯化案例

　　疏水填料—Generik MC60-HIC Butyl（去除率：0.23 log10）

　　样品信息：某单抗-AC Pool，上样载量40 g/L

复合模式层析

　　原理：复合模式层析能同时提供不同类型的相互作用力，包括电荷作用、疏水作用等。由于内毒素通常带大量负电荷，疏水性强，可以通过离子交换电荷效应、疏水等相互作用去除内毒素。

　　优化策略：由于复合模式层析填料兼具离子交换特性和疏水层析特性，优化策略可参考两者。

纯化案例

　　复合阴离子交换填料—Agarosix MC75-MMA（去除率：1.12 log10）

　　样品信息：某单抗 AC Pool，上样载量150 g/L

　　复合阳离子交换填料—Agarosix MC75-MMC（去除率：3.185 log10）

　　样品信息：某单抗 AC Pool，上样载量50 g/L

　　注：log10值为对数去除率（log reduction,LRV，也称对数减少值），0.5-1 log10（去除率：68.4–90%）；

　　1–2 log10（去除率：90–99%）；

　　2–3 log10（去除率：99–99.9%）；

　　3–4 log10（去除率：99.9–99.99%）。

小结

　　根据内毒素的对数去除率（log10值）可以看出，亲和层析和阴离子交换层析的内毒素去除均可以达到2 log10以上，能高效去除内毒素；阳离子交换层析在1.5 log10以上，传统的亲和+阴阳离子纯化工艺累积清除率在5 log10（赛分科技优化策略达到6 log10）以上，在实际生产中应用最为广泛；疏水层析的log10值（小于0.5 log10）较低，去除内毒素效率较低，实际抗体药物纯化工艺中应用较少；复合阳离子交换填料Agarosix MC75-MMC通过一步层析即可实现>3 log10的内毒素去除率，展现出超高效清除能力，为抗体纯化工艺的简化与优化提供新思路。

推荐填料及订购信息

　　注：包装规格为1 L，5 L, 10 L, 50 L，预装柱规格为1 mL, 4.2 mL, 5 mL

互动有礼

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