Nanofilm

• 高的分辨率和分离效率
• 在高浓度盐溶液中非常稳定
• 高的重复性
• 可在低浓度盐溶液中进行蛋白的分离
• 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
• pH适用范围2-9

　　Nanofilm体积排阻（SEC）固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，表面化学键合有一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。该固定相的一个特点是可使用低盐浓度，或含有机溶剂的缓冲液作为流动相进行生物样品的分离，并具有高的分辨率和样品回收率。该色谱填料为窄粒径分布的球形硅胶颗粒。孔径规格有150、250、450和950Å。

高效分离

　　对于生物分离而言，生物分子与填料之间的非特异性相互作用往往会导致低的分离效率，如色谱峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的独特的表面化学技术可以在硅胶表面共价键合一层均匀的聚合物链。这种固定相具有中性和亲水的性质，因此可以最大限度消除填料基质与生物分子，其中尤其是与蛋白之间的非特异性相互作用。这种经过特别设计的涂层可以使Nanofilm SEC柱获得高的分辨率和分离效率。例如，以尿嘧啶作为测试物可以获得高达每米90,000的理论塔板数（见表1）。

表1 Nanofilm SEC柱的柱效，以尿嘧啶为待测物（0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0）

标准蛋白分离

　　赛分Nanofilm SEC柱高效分离的第一个例子见图1。四种蛋白质，甲状腺球蛋白、BSA二聚体、BSA和溶菌酶，以及一种多肽在Nanofilm SEC柱上得到了满意的分离。以溶菌酶计得到的理论塔板数高至30,000/m，因此溶菌酶中的一种杂质都可以得到很好的分离，而这种分离效果通常只有在高效毛细管电泳中才看得到。SEC柱的标准测试样品通常为Biorad 标准蛋白（甲状腺球蛋白、免疫球蛋白G 、卵清蛋白、肌球素）。这些蛋白质的pI均小于7.5，因此在pH=7.0时不会带有明显的正电荷。但是高度带正电荷的蛋白质，如溶菌酶（pI 11.0）、细胞色素（pI 10.6）、抑肽酶（pI 11.0）却容易与填料表面的残余硅羟基发生强静电相互作用而非常难被洗脱。Nanofilm SEC柱不存在这个问题。而且，赛分公司建立了自己的蛋白测试标准样品，其中就包括了对生物分离性能非常敏感的溶菌酶。

图1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上分离4种蛋白和一个多肽。

BSA与BSA二聚体的分离

　　从图2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm），可以获得牛血清白蛋白（BSA）和BSA双聚体的分离，其中流动相为150mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。

甲状腺球蛋白中聚合体的分离

　　甲状腺球蛋白是一个大分子量蛋白（MW 670,000）。商品化的甲状腺球蛋白含有聚合体杂质，可能是双聚体或四聚体。从图3可以看到，Nanofilm SEC-500可以对甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白聚合体实现基线分离。

图3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）从甲状腺球蛋白中分离出聚合体。

流动相: 150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0

流速: 0.35mL/min

检测波长: UV 214nm

温度: 室温（23°C）

进样体积: 5µL

蛋白样品: （1）聚合体；（2）甲状腺球蛋白（1.0mg/mL），670kD

孔结构对分离的影响

　　SEC填料孔径的大小在蛋白分离中起到至关重要的作用。对于在某一特定分子量范围内分布的蛋白样品而言，Nanofilm SEC固定相规格的选择需要基于填料的排除极限和线性分子量范围这两个参数。

图4 Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500柱（5µm, 7.8mm I.D.×300mm）分离效果的比较。

流动相: 150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0

流速: 0.25mL/min

检测波长:UV 280nm

温度:室温（23°C）

进样体积:5µL

样品:（1） 甲状腺球蛋白（1.0mg/mL）， 670kD；（2）BSA （1.0mg/mL），66kD；（3）核糖核酸酶A（1.0mg/mL），13.7kD；（4） 尿嘧啶（2.5mg/mL），120 D

图4为具有不同孔径的Nanofilm SEC柱对分子量在120-670,000之间分布的三种蛋白的分离，从中可以看到Nanofilm SEC填料孔径的不同对分离的影响。

高的蛋白回收率及蛋白活性的保持

　　Nanofilm SEC填料是在硅胶表面最大限度地共价键合一层亲水的中性薄膜。蛋白或其它生物分子与这种填料的相互作用非常小。因此，蛋白在硅胶表面的吸附将会被抑制，这就保证了高的回收率，并可使蛋白在分离之后依然有着高的生物活性。表2是实验测得的酸性蛋白BSA和碱性蛋白溶菌酶的回收率数据。

表2 蛋白在Nanofilm SEC柱上的回收率（色谱柱规格4.6mm I.D.×250mm，流动相为0.15M磷酸盐缓冲液，pH 7.0）

Nanofilm SEC固定相的高稳定性

　　Nanofilm SEC固定相具有致密的涂层键合密度，因此可阻止任意分子破坏硅胶与固定相之间的键合，从而保证填料具有高的稳定性。Nanofilm SEC固定相可用于多种缓冲液中，如醋酸铵、磷酸盐、Tris等。当用150和100mM的磷酸缓冲液（pH7.0）作为流动相时，在3个月或进样1000次后Nanofilm SEC柱的性能仅会发生轻微的改变，保留时间的偏差在5%以内。图5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天运行10小时得到的结果。从图中可以看到流出曲线基本重合。图6是两周内蛋白和一个小分子在500倍柱体积内保留时间的变化情况。从图中可以看到保留时间变化的差异非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高盐浓度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有机溶剂如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其与水的混和溶液中也相当稳定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范围内稳定。另外，在短时间内也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在温度耐受方面表现突出。最高工作温度可达到80°C。

图5 Nanofilm SEC固定相稳定性实验结果

色谱柱: Nanofilm SEC-150(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)

流动相: 150mM和100mM磷酸盐缓冲液, pH 7.0

流速: 0.35mL/min

温度:室温

进样体积:10µL

样品:1. 甲状腺球蛋白(1.0mg/mL)；2. BSA (1.0mg/mL)；3. 核糖核酸酶A(1.0mg/mL)；4. 尿嘧啶(50mg/mL)。每天运行10小时

图6 三种蛋白和尿嘧啶在500倍柱体积内反复进样得到的保留时间的变化情况。测试条件同上图。

蛋白分子量的校正

　　对于SEC而言，填料孔径的大小决定了所能分离的分子量范围，而孔体积则决定了分离容量。Nanofilm填料拥有4种孔径规格，可以覆盖一个宽范围分子量分布的生物大分子。图7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲线。

图5 Nanofilm SEC固定相稳定性实验结果

色谱柱: 4.6mm I.D.´300mm, 填料粒径为5µm

流动相: 150mM磷酸盐缓冲液, pH 7.0

流速: 0.25mL/min

检测波长:214nm

进样体积:5µL

样品:1. 甲状腺球状蛋白(670kD), 2. IgG(150kD), 3. BSA双聚体(132kD), 4. BSA (66kD), 5. 卵清蛋白(44kD), 6. 肌红蛋白(17.6kD), 7. 溶菌酶(14.3kD), 8. B12 (1.35kD), 9. 尿嘧啶(120D)

另一种广泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量对扩散系数（Kd）作图。Kd按下式定义： Kd = (Ve-Vo)/(VT-Vo) 其中Ve、VT和Vo分别是样品洗脱体积，色谱柱的总体积和柱的死体积。蛋白分子量和Kd的线性区间经常会被作为SEC固定相选择的参考。如图8所示，Nanofilm SEC-150在一个宽的分子量范围内分子量和Kd之间有着良好的线性关系。

图8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲线

色谱柱: Nanofilm SEC-150 (4.6mm I.D.×150mm, 5µm)

流动相: 100mM磷酸缓冲液，pH 7.0

流速: 0.25mL/min

检测波长:UV 214nm

温度:室温（23°C）

进样体积:5µL

样品:（1） 甲状腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA双聚体（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）；（6）a-胰凝乳蛋白酶（25KD）；（7）肌红蛋白（17.6kD）；（8）溶菌酶（14.3kD）；（9）多肽样品（1.5kD）；（10）尿嘧啶（120D）

低盐浓度下蛋白的分离

　　对于带正电荷蛋白的分离，往往需要用高盐浓度来减弱硅胶基质与蛋白之间的强静电相互作用。比如细胞色素C是一种富含正电荷的蛋白质（pI=9.6），因此很难在低盐浓度（比如50mM磷酸盐缓冲液， pH 7.0）下被洗脱出来。使用高盐浓度洗脱会限制SEC柱在蛋白分离中的应用。赛分公司所开发的Nanofilm SEC柱可以有效地分离带正电荷的蛋白质。如图9所示，采用Nanofilm SEC-500柱，细胞色素C可以在50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中得到很好的分离，而这种分离效果是其它硅胶基质SEC柱所无法实现的。Nanofilm SEC柱的出现为SEC开拓了许多新的应用领域，例如分离对盐敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究，以及LC/MS检测等。

图9 细胞色素C在不同磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中的流出曲线

色谱柱: Nanofilm SEC-250柱(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)

流速: 0.35mL/min

检测波长:UV 214nm

温度:室温（23°C）

进样体积:5µL

样品浓度:1.0mg/mL

SRT SEC和Nanofilm SEC的比较

　　与Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分离容量和分辨率，可供选择的孔径规格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些应用，如使用低盐浓度或含可挥发性盐的有机溶剂作为流动相进行富含正电荷生物分子的分离，多维色谱分离，以及LC/MS等中表现得更为稳定，而这是传统SEC固定相所无法实现的。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的选择性。SRT和Nanofilm SEC固定相可以组合起来使用，从而可为生物分子，水溶性聚合物，病毒和细菌，以及纳米颗粒等的分离提供一个完整的分离方案。