目前，蛋白A亲和层析俨然是几乎所有治疗性IgG药物纯化的主流技术，其优势在于工艺简洁：IgG可特异性结合蛋白A，而杂质流穿，仅需上样、洗涤和洗脱即可获得目标产物。然而在实际生产中，洗脱产物仍残留数百至数千ppm的宿主细胞蛋白(HCP)和染色质等污染物，表明该技术存在明显的特异性局限。因此，蛋白A亲和层析并非如传统描述那般简单，其复杂性直接影响产品质量属性、纯化工艺开发难度及生产成本控制。深入理解蛋白A亲和层析的作用机制，将有助于优化其应用效能。

为什么蛋白A的生物特异性无法在亲和层析中提供应有的纯度?大量研究表明其主要原因包括其他蛋白质与层析介质之间的非特异性结合，主要杂质与蛋白A配体以及IgG本身之间的非特异性作用，层析过程中IgG在低pH洗脱环境下形成聚集体等。杂质来源于非特异性相互作用等多种因素，下面我们将从几个重要的观点角度来解析蛋白A亲和层析的复杂性，为纯化性能的改进提供理论基础和实际参考。

1 蛋白A与IgG的相互作用

蛋白A亲和层析并非传统认为的“温和过程”。研究发现，蛋白A与IgG的Fc区结合会导致Cγ2结构域及相邻区域的构象变性，甚至使X射线晶体学无法精确定位α碳原子坐标。洗脱后IgG的流体动力学直径不足天然分子的一半，该现象在赫赛汀、阿瓦斯汀等多种抗体中均存在，表明具有普适性。

图1. X射线晶体学显示的与蛋白A接触导致IgG变性*

低pH洗脱条件会加剧变性：在pH 2.0-2.5时，Fab区域会折叠覆盖Fc区域。虽可通过调节pH和离子强度恢复天然尺寸，但变性后的IgG更易聚集。实验显示，将洗脱液(pH 3.5)进一步酸化至pH 3.0后中和，会导致近三分之一抗体聚集，而天然IgG在相同处理下无聚集。这表明蛋白A介导的变性虽不直接引发聚集，但显著提高了IgG对外部应激的敏感性。

蛋白A亲和层析中，杂质-介质/配体/IgG间的非特异性相互作用及低pH洗脱诱发聚集是纯度不足的主因。该发现提示需优化层析条件(如预处理、洗脱控制)以提升载量、减少HCP/DNA残留，为高回收率、低污染工艺开发提供关键方向。

2 染色质与蛋白A的相互作用

染色质作为宿主细胞残留的核心污染物，与蛋白A的结合力甚至超过IgG。其基本单元核小体(含DNA和组蛋白)通过非共价结合形成尺寸50-400 nm的异质聚集体，携带大量非组蛋白宿主蛋白(HCP)、RNA等杂质。这些聚集体因尺寸过大无法进入层析介质孔道，堆积在介质表面，阻塞IgG结合位点，导致结合容量下降高达20%。

在低pH洗脱条件下，染色质聚集体不稳定发生渗漏，使99%的污染物进入IgG洗脱峰。延长柱停留时间会加剧污染物积累。研究揭示染色质形成了“污染物偷渡系统”：其表面组蛋白与蛋白A强结合，携带原本无亲和性的杂质(如DNA)穿透纯化步骤，严重挑战正交工艺设计原则。

解决方案包括：

① 预洗脱去除染色质，可降低HCP和DNA达1000倍;

② 优化洗脱后pH控制(如调节至pH 5.5)促进污染物颗粒化后过滤;

③ 采用强碱清洗介质。

这些发现强调需从“污染物复合体”而非单一分子层面重新设计纯化工艺。

图2. 左图为常规洗脱步骤收集液色谱图;右图为经过预洗脱的收集液色谱图，结果表明常规洗脱后仍存在大量积累的染色质杂聚集体，预洗脱可有效减少染色质杂聚集体含量*

3 IgG与染色质的相互作用

在酸性洗脱条件下(pH 3.5)，IgG与染色质异质聚集体发生显著相互作用，导致其溶解度下降至82%并吸附于沉淀的染色质。洗脱过程中，IgG可结合两类染色质组分：渗漏亚群和持续结合亚群，造成IgG回收率损失(可低至90%)。此外，洗脱后的IgG易与染色质渗漏物(如DNA)形成持久聚集体，因DNA在低pH下作为阳离子交换剂诱导IgG形成不可逆变性构象。

图3. 滴定至不同pH终点的蛋白A亲和层析洗脱液的IgG浊度和宿主蛋白含量*

通过调节洗脱液至pH 5.5并结合微滤，可有效去除颗粒污染物，使HCP和DNA分别降低100倍和1000倍以上。需避免添加盐或精氨酸，以防抵消效益并降低回收率。研究证实预处理去除染色质可大幅提升蛋白A性能，同时强调洗脱后需恢复生理条件以使IgG重构天然构象。这些发现为优化层析工艺、提高产物纯度和收率提供了关键依据。

4 生产工艺改进策略

预先去除染色质可显著提升蛋白A纯化效果。研究证实，染色质提取技术不仅能够大幅降低宿主蛋白(HCP<10 ppm)和DNA(<1 ppb)残留，使后续精纯步骤简化成为可能，还可有效增强病毒清除能力(非包膜病毒降低5 logs，包膜病毒降低9 logs)。

经染色质预处理后，蛋白A柱的NaOH清洗峰显著减小，仅需50 mM NaOH即可达到优于常规100 mM NaOH处理的清洁效果，有望延长层析介质使用寿命。这一发现揭示了多种传统澄清方法均通过间接作用于染色质实现类似效果。目前，针对染色质的系统性管理已成为下游工艺优化核心，推动相关技术快速发展，为治疗性抗体生产提供更高效、经济的纯化解决方案。

小结

蛋白A亲和层析纯化流程中的杂质作用详解

(样品为基于生理条件下澄清的细胞培养收获液，此时未聚集的IgG与染色质异质聚集体无相互作用)

01 上样

IgG接触蛋白A后变性;同时超过80%的染色质异质聚集体流穿层析柱。其余20%结合于介质颗粒外表面，阻塞IgG结合通道，使结合容量降低达20%。这些结合的异质聚集体形成渗漏污染物库，在洗脱阶段引发多重问题。

02 洗涤

缓冲液可洗脱未结合污染物，但许多污染物仍通过结合在蛋白A上的染色质异质聚集体残留。可采用强效缓冲液(含高浓度NaCl、精氨酸、尿素、有机溶剂、表面活性剂、低pH或高pH)进行组合洗涤，以解离异质聚集体内部结合，使部分组分被洗除，从而减少洗脱阶段的污染物渗漏。

03 洗脱

低pH形成“完美风暴”——加剧蛋白A介导的IgG变性并使其从蛋白A解离;促进IgG与染色质异质聚集体形成稳定非特异性结合;导致部分污染物从染色质聚集体解离，但其他组分仍与蛋白A结合。与持续结合的染色质结合的IgG会损失(通常约5%);与解离染色质元件结合的IgG则形成聚集体。IgG组分中99%的宿主污染物源自染色质异质聚集体的解离。NaCl严重降低IgG回收率，精氨酸影响较轻，但两者均加剧染色质聚集体渗漏并抬高洗脱IgG的宿主污染水平。

04 预中和

调节至pH 5.5可使IgG从低pH下与染色质元件的结合中解离，并促使这些染色质元件重新结合成大型异质聚集体颗粒，可通过微滤去除。过滤后宿主污染通常降低至少100倍。此操作仅在无盐或无精氨酸时有效。

05 中和/再生

恢复生理条件使IgG重归天然结构。

06 清洗

50-100 mM NaOH可去除洗脱后仍结合在蛋白A上的大部分染色质聚集体。在洗脱阶段因与蛋白A结合的染色质作用而损失的IgG于此步骤中被回收。

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