胶原蛋白是哺乳动物细胞中最主要的蛋白成分，占全身总蛋白的30%左右，其广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱和韧带中，主要提供机体的强度、支撑、修复和连接作用。结构完整的胶原蛋白是由三条氨基酸链互相缠绕形成，也决定了其生物学活性。胶原蛋白市场火热，重组胶原蛋白以其来源稳定安全，产物纯度高结构可控且不具备病原体风险等优点，受到各胶原蛋白生产厂家的青睐。重组胶原蛋白是通过将人类胶原蛋白的某功能区的基因片段插入微生物或动物细胞中重组表达，通过大规模发酵后分离提纯而得。赛分科技总结实际应用经验，整理了重组胶原蛋白下游纯化工艺及常见问题解析。

重组胶原蛋白下游纯化工艺

　　生物大分子重组表达后一般需要经过下游分离提纯才能得到高纯度高质量的产品，整个过程主要依赖的是目标产物和杂质之间的性质差异来进行分离，重组胶原蛋白的杂质主要分为以下几个类型：HCP（宿主残留蛋白）、降解片段、内毒素、色素等。由于胶原蛋白应用主要在医美领域，产品附加值相较于生物大分子药偏低，因此其对于成本控制要求较高。为此，赛分科技推出了一系列高性价比的胶原蛋白纯化解决方案。

图1. 重组胶原蛋白纯化基本流程

　　胶原蛋白常见表达体系有酵母体系和大肠杆菌体系，由于市场近期对全长胶原蛋白回馈比较好，因此有部分企业也使用哺乳动物细胞表达全长的胶原蛋白。表达体系不同，杂质表现也有不同情况的差异性。

酵母表达体系

　　由于酵母体系多为分泌型表达，因此发酵液纯度相对较高，经过前处理基本可以维持至60%~80%的纯度水平。市面上常见的胶原蛋白类型主要有I型、III型和V型，这三类胶原蛋白的实际pI一般都大于7，同时我们发现，毕赤酵母HCP的pI多呈现酸性，因此可利用其带电性的差异，使用阳离子交换层析进行捕获分离，阳离子交换层析载量高，价格便宜，是放大生产的不错选择。另外胶原蛋白由于长链结构的特殊性，并且重组表达大多不具备三级结构，多呈现单链状态，样品的稳定性一般，因此很多样品都有不同程度的降解碎片，且有些降解碎片和目标物相差很小，仅用阳离子交换很难达到较好的分离。通过实验验证我们得出疏水层析对目标物和片段有不错的分离度，并且胶原蛋白的一级结构通常含有一些羟脯氨酸、羟赖氨酸，所以胶原蛋白的亲水性相较于HCP的亲水性更强。综上所述，对于发酵液纯度高且降解片段少的样品，推荐采取阳离子交换层析的模式去捕获纯化；对于发酵液纯化低且降解片段又比较高的样品，推荐采用阳离子复合疏水层析（MMC）去做第一步的捕获层析。若一步层析比较难达到要求，可增加一步疏水层析做为精纯步骤。

　　推荐填料：

　　阳离子交换层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP

　　复合阳离子交换层析：Agarosix MC75/45-MMC

　　疏水层析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl

大肠杆菌表达体系

　　对于大肠杆菌的胞内可溶性表达样品，经过破胞和澄清过滤后HCP水平依然较高，因此大多数都会在分子构建阶段加入组氨酸标签利用His-tag亲和层析做为第一步捕获纯化。但由于胶原蛋白通常含有降解片段，且有一部分降解片段依然含有His-tag。因此通过Ni亲和层析后纯度依然不能大于95%，需要增加一步层析做为精纯步骤。精纯步骤可选取阳离子交换层析或者疏水层析作考虑。若没有标签可参考酵母体系的纯化工艺。

　　推荐填料：

　　Ni亲和：Agarosix MC90-NTA Ni，Agarosix MC90-Ni Excel

　　阳离子交换层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP

　　复合阳离子交换层析：Agarosix MC75/45-MMC

　　疏水层析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl

哺乳动物细胞表达体系

　　哺乳动物细胞全长表达（非全长可参考酵母体系）：常规的全长表达纯化工艺可参考酵母体系的纯化工艺（MMC+HIC模式），但由于胶原蛋白长度非常长（资料显示通常三螺旋全长在200-300 nm），很难进入层析介质微球的孔里，因此可采取非常规模式去进行层析：

　　1. 采用核壳结构复合模式的层析填料，如赛分科技的Monomix Core 500层析介质，其以高聚物为基球，孔径非常均一，外壳采用特殊处理不和样品吸附，内核拥有疏水氨基的配体，可以在特定条件下将进入孔的分子量相对较小的HCP及片段吸附，全长的胶原流穿从而达到分离效果。

　　2. 尝试使用离子交换的流穿模式，由于胶原蛋白很难进入层析填料的孔里，其载量相对很低，因此我们可以尝试上较高的载量，使杂质蛋白结合在填料上，由于上样载量高，结合在填料上的比例相对较低，也可以有不错的回收率。

　　推荐填料：

　　核壳复合模式：Monomix Core 500

　　阳离子交换层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP

　　复合阳离子交换层析：Agarosix MC75/45-MMC

常见问题解答（FAQ）

　　胶原蛋白类型众多，不同表达体系、不同功能区域片段都有较大的性质差异，下游纯化过程中如果有某些特殊分子还需要做相应调整。经过实际经验积累，赛分科技总结了重组胶原蛋白纯化的一些常见问题，为下游工艺优化提供解决方案。

　　Q1·胶原蛋白在下罐以后，发生比较严重的降解，可能的原因及解决方法？

　　有可能是因为存在蛋白酶水解位点，可以在下罐以后采取高温孵育法灭火蛋白酶，以及在发酵上清加入低浓度的EDTA。

　　Q2·胶原蛋白色素去除困难，选哪种层析方法？

　　发酵色素类型较多，常规的类型有金属离子，糖类，糖蛋白类等，纯阳离子交换很难去除的比较彻底，通常可以使用带有疏水性质的复合离子交换层析MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）或者使用疏水层析色素去除效果会比较好。

　　Q3·阳离子或MMC层析在某些项目工艺复现不好，应该怎么办？

　　由于胶原蛋白的特殊结构，其长度较长可能存在蛋白在填料上占用配位点不均一的情况，因此需要严格控制各组分Buffer的电导和pH（pH计和电导仪也需要经常校准）。

　　Q4·如何进行内毒素去除？

　　由于三类医疗器械要求对内毒素比较高，通常需要做到0.01 EU/mg以下，常规我们可以选择配基密度较高的强阴离子交换层析介质（Monomix Mab60-Q）。纯化条件我们尽可能选择较高的pH和较低的电导（pH需要低于样品pI防止样品结合，另外有些样品高pH不稳定，可在去除效果和稳定性平衡选择较好的pH条件）。

　　Q5·酵母发酵体系的层析前处理需要超滤换液或稀释降低电导，层析方法如何选？

　　某些样品可以采用离子交换复合疏水模式的MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）在不降低电导的情况下，直接进行上样捕获，载量也不受影响。

　　延展阅读

　　赛分科技针对重组胶原蛋白可提供完整的纯化解决方案，纯化效率高、通用性强，更有“明星产品”Agarosix MC75/45-MMC复合阳离子填料推荐及案例分享，欢迎阅读：

　　重组胶原蛋白纯化“明星产品”—Agarosix MC75/45-MMC

　　重组胶原蛋白纯化解决方案

推荐填料及订购信息

　　注：包装规格为1L，5 L, 10 L, 50 L，预装柱规格为1 mL, 4.2 mL, 5 mL