引言

　　治疗性蛋白质在生产过程中会经历各种翻译后修饰（post-translational modification，PTM），其中蛋白质酪氨酸硫酸化（protein tyrosine sulfation，PTS）由细胞内酶酪氨酸硫转移酶（tyrosylprotein sulfotransferase，TPST）催化而形成。同时修饰产生的磺酸基会对蛋白分子表面电荷分布造成影响，从而增加产物异质性，影响其靶标结合能力，是治疗性蛋白质的关键质量属性之一。

　　近日，赛分科技客户百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）发表相关文章，介绍了一种基于疏水相互作用色谱（HIC）定量分析PTS的方法。研究人员利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱，根据硫酸化程度不同，在pH为4的条件下对目标双特异性抗体进行分离和定量，结果显示未硫酸化峰、单硫酸化峰、双硫酸化峰均实现了基线分离，且回收率在90%以上。研究表明该方法适用于蛋白PTS定量分析。

背景介绍

　　2017年，科学家证实了CHO细胞产生的抗体轻链CDR区存在硫酸化的酪氨酸，且这种修饰会导致其与同源抗原的结合减少。因此，对硫酸化修饰产物进行严格的质量控制十分必要。通常情况下，鉴定和定位肽和蛋白质中PTM的基本方法是反相色谱-质谱分析。但是酪氨酸硫酸化修饰对酸、热和高能电离技术较敏感，在检测过程中很容易被破坏而无法被检出。若使用离子交换色谱法或等电聚焦法进行分析，结合硫酸化酶处理可以检测到酪氨酸硫酸化的存在，但由于硫酸化修饰和其他带负电荷的变体（如脱酰胺）发生峰重叠，会导致定量不准确。因此，为了实现对硫酸化变体分离与定量分析，研究人员选择赛分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱。这种色谱柱结合了表面改性的PS-DVB与丁基配体，可以准确地对硫酸化变体进行分析和定量，确保目标治疗性抗体的质量稳定。

文章概述

　　本研究利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱对重组双抗中的硫酸化分子进行定量分析。与竞品相比，该款色谱柱可以实现更好的分离效果。此外，与离子交换色谱法对比发现，该方法对酪氨酸硫酸化表现出高特异性。尽管磺酸基团会增加抗体表面亲水性，但凭借赛分科技专有的固定相表面修饰技术，Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱可以减少非特异性相互作用，从而避免常见PTM如强制脱酰胺对定量分析的影响。进一步研究表明，该测定方法可以对硫酸化修饰的治疗性蛋白质进行高效准确的分析检测和质量控制。

硫酸化变体分析

　　Column: Vendor Butyl-NPR (2.5 μm, 4.6 × 100 mm)

　　               Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 100 mm)

　　Mobile Phase: 

　　A: 80 mM sodium phosphate pH 7.0 with 2 M ammonium sulfate

　　B: 100 mM sodium phosphate pH 7.0, (gradient elution)

　　Flow Rate: 1 mL/min

　　Temp: 25 °C

　　Detection: 220 nm

　　Sample Amount: 5 μL，10mg/mL

图1. 不同基质的Butyl 疏水色谱柱的磺化双抗分离图谱（pH 7.0）

（A.Vendor Butyl-NPR测试图；B. Proteomix HIC Butyl-NP5测试图）

　　图1是竞品PMA基质的HIC色谱柱和赛分科技PS-DVB基质的Proteomix HIC Butyl-NP5在pH 7.0下的分离图谱。从图中可以看出，经硫酸化酶处理后，小峰消失，主峰升高。这表示sY1和sY2峰与酪氨酸硫酸化有关，其中sY1为单硫酸化峰，sY2为双硫酸化峰，而sY0则为未硫酸化的峰。图1A和图1B中两个小峰与主峰分离，洗脱顺序相反。这是因为Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱专有的表面修饰工艺。对比可知，图1.A中sY0和sY1峰之间的分离度是0.6，而图1.B中则是1.0，说明Proteomix HIC Butyl-NP5的分辨率优于竞品。

脱酰胺化分析

　　脱酰胺是翻译后修饰产物最常见的降解途径之一，研究人员通过强制脱酰胺来评估应用Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱HIC的方法是否受到这种蛋白质降解的影响。

　　为了避免双抗样品自身羧基对电荷及疏水性的潜在影响，研究人员采用pH值为4的流动相，确保在此条件下HIC方法样品根据硫酸化程度差别分离双抗，并且保证sY0、sY1和sY2三个峰的基线分辨率均高于1.5。

图2.不同分离模式下脱酰胺前后的双抗样品检测图谱

（A.离子交换模式.B.疏水模式）

　　图2展示了pH为4的条件下，不同分离模式下对于脱酰胺样品的分离情况。图1.A显示，在pH值为4时，脱酰胺使酸性基团从21.1%增加到36.3%。而如图1.B所示，sY0峰从74.2%略微下降到73.4%，伴随有一个小的早期洗脱峰从0.2%上升到0.9%。sY1和sY2的水平相对稳定，分别在23.0%和2.7%左右，整体无显著变化。双抗脱酰胺前后进行离子交换和疏水色谱的分析结果显示脱酰胺对HIC法测定的该双抗硫酸化变体没有影响，Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱可以避免与质子化产物发生非特异性相互作用。

实验结论

　　综上所述，研究人员使用赛分科技Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱，提供了一种新的有效分析手段，可以在pH为4的条件下对抗体的硫酸化变体进行定量检测。此外，该方法对酪氨酸硫酸化具有高特异性，不受其他常见PTMs（如脱酰胺化）的影响。实验证明该方法是控制硫酸化修饰这一重要质量属性的有效手段。

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